Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

Riepilogo

Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).

Abstract

Differenziazione e impegno delle cellule eritroidi procedere attraverso l'attivazione di una rete di transcriptional lignaggio-limitata orchestrata da un gruppo di destino delle cellule determinazione e fattori di maturazione. Abbiamo precisato in precedenza per definire il set minimo dei fattori necessari per istruire il globulo rosso sviluppo utilizzando discendenza diretta riprogrammazione dei fibroblasti in progenitori/precursori eritroidi indotta (iEPs). Abbiamo mostrato che la sovraespressione di Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) può rapidamente convertire murine ed umane fibroblasti direttamente a iEPs che assomigliano alle cellule eritroidi bona fide in termini di morfologia, fenotipo, e l'espressione genica. Intendiamo che iEPs fornirà uno strumento prezioso per studiare il regolamento di destino delle cellule e di eritropoiesi. Qui descriviamo il processo graduale di conversione fibroblasti punta coda murino in iEPs tramite trascrizione factor-driven discendenza diretta riprogrammazione (DLR). In questo esempio, eseguiamo la riprogrammazione in fibroblasti dai topi di lignaggio traccia degli eritrociti che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) sotto il controllo del promotore del gene (EpoR) del recettore dell'eritropoietina, consentendo la visualizzazione di cellule eritroidi induzione di destino su riprogrammazione. A seguito di questo protocollo, fibroblasti possono essere riprogrammati in iEPs entro cinque-otto giorni.

Mentre possono ancora essere apportati miglioramenti al processo, indichiamo che GTLM-mediata riprogrammazione è un processo rapido e diretto, producendo cellule con proprietà di bona fide cellule eritroidi progenitrici e precursore.

Introduzione

Globuli rossi (RBCs) sono essenziali in tutti i vertebrati e costituiscono l'84% di tutte le cellule dei corpi umani¹. Da embrionali alla vita adulta, la nostra salute dipende altamente esatta regolazione dell'omeostasi di RBC. La produzione costante di RBCs maturo nel corso dello sviluppo in età adulta è noto come eritropoiesi. Una sfida importante nella ricerca di eritropoiesi è quello di definire i regolatori matrici che orchestrano sviluppo di RBC e lo switch tra eritropoiesi primitivo e definitiva. Discendenza diretta riprogrammazione dei progenitori eritroidi rappresenta un'opportunità per capire meglio degli eritrociti sviluppo in vivo.

Discendenza diretta riprogrammazione (DLR), noto anche come transdifferenziazione, è il processo di riprogrammazione di un tipo delle cellule direttamente in un altro, bypassando pluripotenti e fasi di progenitrici multipotenti. DLR finora è stato utilizzato per la produzione di numerosi tipi cellulari inclusi neurali², ematopoietico^3,4,5, epatica⁶ e nefrotica⁷, cellule progenitrici. Per i biologi dello sviluppo, DLR è diventato uno strumento importante per inquisitorie aspetti dell'impegno di lignaggio e differenziazione terminale processi^8,9. DLR possono integrare e sostituire parzialmente in vivo studi per comprendere i meccanismi del destino delle cellule durante lo sviluppo i fattori determinanti. Il protocollo DLR per la riprogrammazione di progenitori eritroidi descritti in questo documento fornisce il campo un metodo gratuito per studi evolutivi dell'eritropoiesi.

Precedentemente abbiamo dimostrato che la sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per riprogrammare i fibroblasti sia murini ed umani direttamente ai progenitori eritroidi indotta (iEPs) ¹⁰. cellule eritroidi riprogrammato il GTLM assomigliano notevolmente bona fide degli eritrociti primitivi progenitori in termini di morfologia, fenotipo e gene espressione¹⁰. Così iEPs hanno una limitata capacità di proliferazione e matura in eritrociti nucleati simili a quelle prodotte transitoriamente nell'embrione precoce prima dell'inizio della eritropoiesi definitivo. Apportando modifiche nelle condizioni riprogrammazione (per esempio, mutazioni puntiformi nella riprogrammazione fattori o aggiunta di altri fattori), si può capire come questo comporti cambiamenti nello sviluppo degli eritrociti e differenziamento. Ad esempio abbiamo indicato che aggiunta di Klf1 o Myb al cocktail GTLM cambia il modello di espressione della globina da prevalentemente embrionale (primitivo) per principalmente per adulti (definitivo). Questa individuazione conferma la validità dell'utilizzo di DLR come strumento per la definizione dei fattori dello sviluppo nella eritropoiesi.

Qui, descriviamo il processo di generazione iEPs da fibroblasti di topo coda punta (TTF). Nei nostri risultati rappresentativi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor- Cre R26- eYFP) che esprimono la proteina fluorescente gialla (eYFP) dal locus Rosa26 in tutte le cellule che hanno espresso il recettore dell'eritropoietina, permettendo facile visualizzazione di impegno per la stirpe degli eritrociti. Utilizzando questo metodo, YFP positivo (EpoR +) cellule sono presenti già cinque giorni dopo la trasduzione. Questo protocollo, pertanto, offre una tecnica veloce e affidabile per la generazione di progenitori eritroidi in vitro.

Protocollo

1. stabilimento ed il mantenimento della coda del Mouse primario suggerimento culture del fibroblasto

1. Preparare piatti rivestite con gelatina (consigliamo un piatto di 10 cm per una coda) che copre la superficie con 0,1% di gelatina e incubando i piatti per circa 20 min a 37 ° C. Aspirare la soluzione di gelatina dal piatto e lasciare asciugare per almeno 2 h.
2. Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Rimuovere la coda con le forbici, tagliare alla base della coda. Mettere la coda in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) con 2% siero bovino fetale (FBS) fino all'uso.
   Nota: Per ottenere risultati ottimali, code devono essere prelevate da topi circa 6-8 settimane di età. Tails può essere assunto dai topi più vecchi di 8 settimane di età, tuttavia, come l'età di topi, la capacità di proliferazione dei fibroblasti e l'efficienza della riprogrammazione diminuzione¹¹.
3. Eseguire tutti i passaggi successivi del presente protocollo in una cappa di coltura del tessuto in condizioni sterili. Preparare una soluzione diluita della tripsina di tripsina-EDTA 0.02% in DPBS e aggiungere 5 mL in un piatto non patinata cm 10.
4. Lavare la coda, prima in etanolo al 70%, poi in DPBS. In un piatto, mettere la coda piatte e utilizzare pinze per tenerlo in posizione. Fare un'incisione sulla coda lungo il suo asse longitudinale dalla base alla punta.
5. Afferrare la coda con un paio di pinze e tenerlo verticalmente. Utilizzando un secondo paio di pinze, afferrare la pelle accanto l'incisione alla base della coda e staccarla indietro. Effettuare questa operazione su entrambi i lati dell'incisione fino a quando la pelle può essere staccata tirando verso il basso verso la punta della coda.
6. Tenere la coda pelata con forcipe sopra il piatto contenente la soluzione di tripsina e tagliare la coda in pezzi lunghi circa 1 cm. Con i pezzi di coda nella soluzione di tripsina, usare le forbici per frammentare i pezzi in pezzi più piccoli. Incubare i pezzi di coda nella soluzione di tripsina a 37 ° C per 10 min.
   Nota: Il più piccolo i pezzi sono preferiti in modo da fornire ogni pezzo un'elevata superficie in rapporto al volume.
7. Placare la tripsina usando 2 volumi di mezzo di espansione (FEX) del fibroblasto (alto-glucosio Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 15% FBS, 2 mM L-Glutammina, gli aminoacidi Non essenziali (NEAA) e 100 U/mL di penicillina/streptomicina).
8. Raccogliere tutto il contenuto del piatto in un tubo da 50 mL e centrifugare a 350 × g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere i frammenti di coda in 10 mL di mezzo FEX fresco.
9. Trasferire frammenti di coda in mezzo ad un piatto di gelatina-rivestito e incubare a 37 ° C in 5% CO₂ e 4% O₂, l'aggiunta di mezzo FEX fresco ogni 2 giorni.
   Nota: Dopo cinque-sette giorni, frammenti di coda hanno fissato nella parte inferiore del piatto e fibroblasti possono essere visto allontanarsi da loro.
10. Una volta che i cluster dei fibroblasti sono macchiati, agitare delicatamente il piatto per sloggiare i pezzi di coda e aspirare il mezzo e tutti i frammenti di osso lasciando i fibroblasti fissati alla piastra. Aggiungere il nuovo terreno FEX e cultura i fibroblasti fino confluenti.
11. Per non garantire la contaminazione dei fibroblasti di progenitori ematopoietici, dissociare le cellule dalla piastra con 1 x tripsina-EDTA per 5 minuti e raccogliere le cellule. Impoveriscono per le cellule che esprimono marcatori ematopoietici (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 e Ter-119) utilizzando un sistema di separazione magnetica¹⁰.

2. retrovirus produzione

1. Cellule di imballaggio retrovirali a circa 2,5 × 10⁴ cellule/cm² (2,0 × 10⁶ celle per un piatto di 10 cm) su una piastra di coltura del tessuto-trattati (a vuoto-gas plasma) e cultura pernottamento in alto-glucosio DMEM con 10% di semi FBS, 10 mM sodio Piruvato e 100 U/mL di penicillina/streptomicina a 37 ° C e 5% CO₂.
2. La mattina seguente, è necessario modificare il mezzo in DMEM senza additivi utilizzando la metà del volume usata per coltura durante la notte (5 mL per un piatto di 10 cm). Nel pomeriggio, verifica che le cellule sono 70-80% confluenti e iniziano la transfezione.
3. Per ogni fattore di riprogrammazione, Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc, preparare una miscela 2:1 del vettore di espressione (pMX) e vettore di supporto (che contiene geni gag e pol). Per un piatto di 10 cm di fibroblasti, utilizzare 6 µ g di vettore di espressione e 3 µ g del vettore helper in un volume finale di 100 µ l in mezzo DMEM.
4. Per ogni fattore di riprogrammazione, preparare 300 µ l di temperatura ambiente (TA) DMEM in una provetta sterile in polistirolo e attentamente 27 µ l di reagente di transfezione commerciale.
   Nota: Il reagente di transfezione prima dell'uso deve essere portato a RT e deve essere aggiunto direttamente nel mezzo come la proprietà elettrostatiche del composto può rendere attaccano alla parete del tubo di plastica.
5. Aggiungere il mix di plasmide nel tubo contenenti reagente di transfezione, vortex brevemente e incubare la miscela reagente-DNA di transfezione per 15 min a RT. brevemente vortice la miscela e aggiungere goccia a goccia per le cellule di imballaggio retrovirali affinché la transfezione mix di reagente-DNA è uniformemente sopra la coltura e incubare a 37 ° C durante la notte.
6. 24 ore dopo la trasfezione, modificare il mezzo in DMEM con 20% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro di formato del poro siringa da 0,22 µm.
   Nota: Surnatanti virali possono essere congelati a-80 ° C e tenuti fino a quando richiesto, anche se la trasduzione è più efficiente se fresco surnatante virale viene utilizzato.

3. GTLM trasduzione e raccolto iEP

1. Seme la coda punta fibroblasti 1 × 10⁴ cellule/cm² su 0,1% gelatina prepatinato piatti nel mezzo di FEX e incubare a 37 ° C per 24 h.
2. Il giorno seguente, preparare una miscela di trasduzione come segue.
   1. Aggiungere 1 volume del surnatante virale per ogni fattore di riprogrammazione completati con 4 µ g/mL di reagente di infezione retrovirale (40%) a 6 volumi di mezzo FEX (60%).
   2. Per un piatto di 10 cm di fibroblasti, aggiungere 1 mL di ciascuna surnatante virale (virus × 4 = 4 mL) completati con 4 µ g/mL di reagente di infezione retrovirale da 6 mL di mezzo di FEX, dando un totale di 10 mL di miscela di trasduzione.
3. Aspirare il mezzo di FEX dalla coltura del fibroblasto e sostituirlo con la miscela di trasduzione. Incubare la trasduzione per 4 h a 37 ° C in condizioni di ipossia (5% CO₂ e 4% O₂).
4. Aspirare la miscela di trasduzione e sostituirlo con fresco riprogrammazione medio (medium privo di siero espansione (SFEM), 100 U/mLPenicillin/streptomicina, 100 ng/mL murino Stem Cell Factor (mSCF), 10 ng/mL murino interleukin-3 (IL3), ricombinante umano di 2 U/mL Eritropoietina (hrEPO) e 100 nM desametasone).
5. Incubare per 8 giornata 37 ° C in condizioni di ipossia, aggiungendo mezzo riprogrammazione fresco ogni 2 giorni. Dopo cinque-otto giorni, riprogrammazione riuscita resa di aggregati di cellule che hanno staccato dalla piastra.
6. Per raccogliere le cellule riprogrammate per l'analisi, pipettare delicatamente su e giù per raccoglierle direttamente dal piatto. Per raccogliere untransduced fibroblasti per il confronto, dissociare le cellule dalla piastra con 1 x tripsina-EDTA e raccogliere.

Risultati

Qui presentiamo un protocollo riproducibile per la produzione di iEPs dai fibroblasti adulti utilizzando trascrizione factor-driven DLR. Valutiamo la riprogrammazione delle cellule tramite flusso cytometry, formanti colonie saggi e gene analisi di espressione. Al fine di facilitare la visualizzazione della conversione al destino delle cellule eritroidi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor- Cre R26- eYFP...

Discussione

Sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per la riprogrammazione di fibroblasti murini ed umani direttamente a iEPs¹⁰. Cellule eritroidi riprogrammate notevolmente ha assomigliato a bona fide progenitori eritroidi in termini di morfologia, fenotipo, espressione genica e possibilità di formazione di colonie. Questa scoperta co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01	Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30243.01	Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)	Stem Cell Technologies	9650	Reprogramming media
Fetal Bovine Serum HyClone	GE Life Sciences	SH30071.03HI	Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)	Ge Life Sciences	SV30010	Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)	Thermo Fisher	11140050	SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)	GE Life Sciences	SH30042.01	Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)	Peprotech	250-03	Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3	Peprotech	213-13	Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)	Peprotech	100-64	Added to reprogramming media
Dexamethasone	Sigma	50-02-2	Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin	Sigma	9000-70-8	Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride	Sigma	3/9/3513	Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Ge Life Sciences	SH30850.03	Used for washing steps
Polybrene	Merck	TR-1003-G	Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm	Merck	SLGP033RS	Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe	Becton Dickinson	SKU: 307736	Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish	Corning	430167	Cell culture
6-well plate	Falcon	10799541	Cell culture
Jeweler Forceps #5	Sklar	66-7642	Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors	Sklar	23-1149	Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-224	For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells	ATCC	CRL-3215	retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)	Novus Biologicals	NBP2-29540	retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1	Cloned in-lab
pMX-Tal1	Cloned in-lab
pMX-Lmo2	Cloned in-lab
pMX-cMyc	Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software			Cytospin analysis software