JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Özet

Erythroid hücre bağlılık ve farklılaşma etkinleştirmesi belirleme ve faktörler olgunlaşması hücre kaderi bir grup tarafından düzenledi lineage tarafından kısıtlanmış transkripsiyon ağ üzerinden devam etmek. Biz daha önce faktörler doğrudan lineage fibroblastlar indüklenen erythroid ataları/öncüleri (iEPs) yeniden programlama kullanarak kırmızı kan hücresi geliştirme talimat için gerekli en az sayıda tanımlamak için yola çıktı. Biz bu overexpression Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc (GTLM) hızlı bir şekilde dönüştürmek fare ve insan fibroblast doğrudan bona fide erythroid hücre morfolojisi, açısından benzer iEPs için olabilir gösterdi fenotip, ve gen ekspresyonu. Biz iEPs arttığından ve hücre kader düzenleme eğitim için paha biçilmez bir araç sağlamak niyetindeyim. Burada fare kuyruk ucu fibroblastlar (DLR) yeniden programlama iEPs üzerinden transkripsiyon faktörü uygulamalı doğrudan lineage dönüştürme kademeli işlemi açıklanmaktadır. Bu örnekte, biz fibroblastlar gelen sarı floresan protein (YFP) erythroid hücre görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör gen (EpoR) düzenleyici kontrolü altında hızlı erythroid soy izleme fareler içinde yeniden programlama yapmak yeniden programlama üzerine kader indüksiyon. Bu iletişim kuralı fibroblastlar beş-sekiz gün içinde iEPs programlanabilir.

Gelişmeler hala süreci için yapılabilir iken, biz GTLM-aracılı yeniden programlama hızlı ve doğrudan bir süreç, bona fide özelliklerini içeren hücreleri erythroid yaratıcı ve öncü hücreleri verimli gösteriyor ki.

Giriş

Kırmızı kan hücreleri (RBCs) tüm omurgalıların gereklidir ve tüm hücreleri insan organları%184'yapmak. Yetişkin yaşam için gelen embriyonik, sağlığımız çok RBC homeostazı tam regülasyonu bağlıdır. Olgun RBCs geliştirme yetişkinlik boyunca devam eden üretim arttığından bilinir. RBC geliştirme ve ilkel ve kesin arttığından arasında geçiş alacak ana düzenleyiciler tanımlamak için arttığından araştırma büyük bir sorun olduğunu. Doğrudan soy erythroid ataları yeniden şekillendirmek için daha erythroid geliştirme içinde vivoanlamak için bir fırsat sunuyor.

Doğrudan soy da transdifferentiation bilinen (DLR), yeniden programlama pluripotent ve multipotent progenitör aşamaları atlayarak bir hücre tipi doğrudan içine başka yeniden programlama işlemidir. DLR, sinirsel2, hematopoetik3,4,5, hepatik6 ve nefrotik7, progenitör hücre de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri üretmek için şu ana kadar kullanılmıştır. Gelişimsel biyologlar için DLR lineage bağlılık ve terminal farklılaşma işlemler8,9sorgulama yönleri için önemli bir araç haline gelmiştir. DLR tamamlayan ve kısmen in vivo çalışmalar anlayış mekanizmaları hücre kader geliştirme sırasında faktörlerin belirlenmesi için değiştirin. Bu raporda açıklanan erythroid ataları yeniden programlama için DLR protokol alanı arttığından gelişim çalışmaları için ücretsiz bir yöntem sağlar.

Daha önce dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast doğrudan bağlı erythroid ataları için yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermiştir (iEPs) 10. erythroid GTLM yeniden programlanan hücreler büyük ölçüde bona fide ilkel erythroid ataları morfoloji, fenotip ve gen ifade10açısından benzer. Böylece iEPs nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesi sınırlı ve çekirdekli eritrositler geçici kesin arttığından başlangıcından önce erken embriyo üretilen benzer olgun. (Örneğin, nokta faktörler veya diğer faktörlerin yanı sıra yeniden programlama içinde mutasyonlar) programlama koşullarında değişiklikler yaparak, biri nasıl bu erythroid geliştirme ve farklılaşma değişikliklere neden anlayabiliyorum. Biz örneğin Klf1 veya Myb eklenmesi için GTLM kokteyl globin ifade deseninin ağırlıklı olarak embriyonik (ilkel) değişiklikleri için esas olarak yetişkin göstermiştir (kesin). Bu bulgu DLR arttığından gelişimsel faktörleri tanımlamak için bir araç olarak kullanarak geçerlilik doğruluyor.

Burada, iEPs fare kuyruk ucu fibroblastlar (TTF) oluşturma işlemine anahat. Temsilcisi sonuçlarımızda fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Rosa26 odağı tüm gelen sarı floresan protein (eYFP) ifade bu hücreleri erythroid soy bağlılık kolay görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör ifade ettiler. Bu yöntemi kullanarak, YFP pozitif (EpoR +) hücrelerinin beş gün sonra iletim gibi erken mevcut. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, erythroid ataları vitroüretimi için hızlı ve sağlam bir teknik sunar.

Protokol

1. kuruluş ve bakım birincil fare kuyruk Fibroblast kültürler İpucu

  1. % 0.1 jelatin ile yüzeyini örten ve bulaşıkları yaklaşık 20 dk 37 ° C'de için kuluçka (10 cm çanak bir kuyruk için tavsiye) jelatin kaplı yemekleri hazırlamak Çanak jelatin çözümden Aspire edin ve en az 2 h için kurumasını bekleyin.
  2. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. Kuyruk kuyruk tabanında kesme makasla kaldırın. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) kuyrukta % 2 fetal Sığır serum ile (FBS) kullanıma hazır kadar koymak.
    Not: en iyi sonuç için kuyrukları yaklaşık 6-8 hafta-in yaş fareler alınmalıdır. Kuyrukları fareler 8 hafta-in yaş, ancak, büyük fareler yaş, fibroblast proliferasyonu kapasitesini ve azalma11yeniden programlama verimliliğini olarak alınabilir.
  3. Doku kültürü başlıklı steril koşullarda bu protokolün tüm sonraki adımları uygulayın. %0,02 tripsin-EDTA DPBS içinde seyreltilmiş tripsin çözeltisi hazırlamak ve 5 mL kaplamasız 10 cm çanak içine ekleyin.
  4. Kuyruk, % 70 etanol ilk, sonra DPBS yıkayın. Bir tabak içinde kuyruk düz ve forseps yerde tutmak için kullanın. Bir kesik ucuna tabanından boyuna ekseni boyunca kuyruk üzerinde olun.
  5. Kuyruk forseps bir çift ile kavramak ve dikey olarak tutun. Forseps ikinci bir çifti kullanarak, cilt üssünde kesik kuyruk yanında kavrama ve geri soyma. Belgili tanımlık kesme her iki tarafında, cildi aşağı kuyruk ucuna doğru çekerek soyulmuş kadar bunu.
  6. Soyulmuş kuyruk forseps ile tripsin solüsyon içeren çanak üzerinde tutun ve kuyruk yaklaşık 1 cm uzun parçalar halinde kesin. Tripsin çözümde kuyruk taşlarla parçaları daha küçük parçalar halinde parçalara ayırması makas kullanın. Kuyruk parçalar için 10 dk. 37 ° C'de tripsin çözümde kuluçkaya.
    Not: Küçük parçalar böylece her parça için hacim oranı yüksek bir yüzey alanı sağlamak için tercih edilmektedir.
  7. Fibroblast genişleme (FEX) Orta 2 birimleri kullanma tripsin gidermek (yüksek glikoz Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) % 15 ile FBS, 2 mM L-glutamin, Sigara-esansiyel amino asitler (NEAA) ve 100 U/mL penisilin/streptomisin).
  8. 50 mL tüp ve 4 ° C'de 5 min için 350 × g , santrifüj çanak tüm içeriğini toplamak Süpernatant Aspire edin ve kuyruk parçaları 10 mL taze FEX orta resuspend.
  9. Jelatin kaplı yemek için kuyruk parçaları orta aktarmak ve % 5 CO2 ve %4 O2taze FEX Orta 2 günde ekleme, 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: 5-7 gün sonra çanak alt kısmında kuyruk parçaları eklediyseniz ve onlardan uzak hareket fibroblastlar görülebilir.
  10. Fibroblastlar kümeleri fark sonra yavaşça kuyruk parçaları çıkarmak ve orta ve plaka bağlı fibroblastlar bırakarak tüm kemik parçaları Aspire çanağı sallamak. Yeni FEX orta ekleyin ve fibroblastlar birleşmesi kadar kültür.
  11. Fibroblastlar hematopoetik ataları tarafından hiçbir kirlenme emin olmak için 5 dakika için 1 x tripsin-EDTA kullanarak plaka hücrelerden ayırmak ve hücreleri toplamak. Hematopoetik işaretleri ifade hücreler için tüketmek (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 ve Ter-119) kullanarak bir manyetik ayırma sistemi10.

2. retrovirüsü üretim

  1. Tohum retroviral ambalaj hücreleri yaklaşık 2.5 × 104 hücreleri/cm2 (2.0 × 106 hücre 10 cm yemek için) bir çanak (tarafından elektrik-gaz plazma) doku kültürü tedavi ve geceleme yüksek glikoz DMEM % 10 ile kültür FBS, 10 mM sodyum Pyruvate ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C ve % 5 CO2.
  2. Ertesi sabah, orta yarım birimi gecede kültür için kullanılan (10 cm yemek için 5 mL) kullanan hiçbir katkı maddesi ile DMEM için değiştirin. Öğleden sonra kontrol edin hücreleri % 70-80 birleşmesi ve transfection başlar.
  3. Programlama her faktör için Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc, ifade vektör (pMX) ve Yardımcısı vektör (gag ve pol genleri içeren) 2:1 karışımı hazırlayın. Fibroblastlar 10 cm fincan için 6 µg ifade vektör ve yardımcı vektör DMEM ortamda 100 µL son bir hacim içinde 3 µg kullanın.
  4. Programlama her faktör için steril bir polistren tüp içinde oda sıcaklığında (RT) DMEM 300 µL hazırlamak ve ticari transfection reaktif 27 µL dikkatle ekleyin.
    Not: Transfection reaktif RT için kullanmadan önce getirilmelidir ve bahçedeki elektrostatik özellikleri bu tüp Plastik duvara sopa yapabilir gibi doğrudan orta eklenmesi gerekir.
  5. Plazmid karışımı transfection reaktif içeren Tüp, kısaca girdap içine ekleyin ve transfection reaktif-DNA karışımı 15 dakika RT. kısaca girdap karışımı, kuluçkaya ve dropwise retroviral ambalaj hücrelere ekleyin böylece transfection reaktif-DNA karışımı kültür üzerinde eşit olarak yayılmış ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  6. 24 h transfection sonra DMEM için % 20 ile orta değiştirmek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin. 48 h transfection sonra süpernatant toplamak ve 0,22 µm gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre.
    Not: Viral supernatants-80 ° C-dondurulmuş ve iletim taze viral süpernatant kullanılırsa daha verimli olmasına rağmen gerekli kadar tutulur.

3. GTLM iletim ve IEP hasat

  1. Kuyruk ön kaplamalı jelatin %0,1 1 × 104 hücreleri/cm2 fibroblastlar ipucu tohum FEX ortamda yemekleri ve 24 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. Ertesi gün, aşağıdaki gibi bir iletim karışımı hazırlayın.
    1. 1 4 µg/mL ile retroviral enfeksiyon reaktif (% 40) desteklenen programlama her faktör için viral süpernatant hacmi FEX Orta (%60) 6 cilt için ekleyin.
    2. Fibroblastlar 10 cm fincan için 1 mL her viral süpernatant ekleyin (4 × virüs 4 mL =) 10 mL iletim karışımı toplam verilmesi 4 µg/mL retroviral enfeksiyon reaktif FEX orta, 6 ml ile desteklenmiştir.
  3. Fibroblast kültür ortamından FEX Aspire edin ve iletim karışımı ile değiştirin. İletim (%5 CO2 ve %4 O2) hipoksik koşullarda 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.
  4. İletim karışımı Aspire edin ve eski yerine koymak o ile taze programlama Orta (Serum-Alerjik genişleme Orta (SFEM), U/mLPenicillin/streptomisin 100, 100 ng/mL fare kök hücre faktör (mSCF), 10 ng/mL fare interlökin-3 (IL3), 2 U/mL insan rekombinant Eritropoietin (hrEPO) ve 100 nM deksametazon).
  5. 8 günlüğüneonda taze programlama Orta 2 günde ekleme hipoksik koşullarda 37 ° C için kuluçkaya. Beş-sekiz gün sonra başarılı yeniden programlama plaka ayırdıktan hücre kümeleri ortaya çıkarır.
  6. Analiz için programlanmış hücreleri toplamak için yavaşça yukarı ve aşağı onları yemek doğrudan hasat için pipet. Karşılaştırma için untransduced fibroblastlar hasat için 1 x tripsin-EDTA kullanarak plaka hücrelerden ayırmak ve toplamak.

Sonuçlar

Burada iEPs gelen yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı DLR kullanarak üretim için tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Akış Sitometresi, koloni oluşturan deneyleri ve gen kullanarak hücre yeniden programlama değerlendirmek ifade analizi. Görselleştirme erythroid hücre kaderi dönüşüm yardımcı olmak amacıyla, fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Sarı floresa...

Tartışmalar

Dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast iEPs10için doğrudan yeniden programlamak için yeterli. Programlanmış erythroid hücreleri bona fide erythroid ataları morfoloji, fenotip, gen ekspresyonu ve koloni kurma yeteneği açısından büyük ölçüde andıran. Bu bulgu gelişimsel faktörler hematopoiesis içinde tanımla...

Açıklamalar

Yazarlar raporlanacak hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Biz Evelyn Wang ve Gregory Hyde (Whitehead Enstitüsü, Cambridge, MA) klonlama ve Harvey Lodish (Whitehead Enstitüsü) için birçok retroviral kütüphane oluşturmak için kullanılan plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz berkay Siva ve Sofie Singbrant (Moleküler Tıp bölümü ve gen terapisi, Lund Üniversitesi), Göran Karlsson ve Shamit Soneji (moleküler Hematoloji Bölümü, Lund Üniversitesi) Açıklama IEP üretim rolleri için teşekkür ederim. Ayrıca kabul ve teşekkür Julian Pulecio (rejeneratif tıp merkezi, Barcelona Biyomedikal Araştırma Parkı), Violeta Rayonu-Estrada (The Rockefeller Üniversitesi, New York), Carl Walkley istiyorum (St. Vincent'ın Enstitüsü tıbbi araştırma ve Bölümü tıp, St Vincent'ın hastane, Melbourne Üniversitesi), Ángel Raya (Katalan kurumun araştırma ve ileri araştırmalar, Barcelona) ve Vijay G. Sankaran (Broad Enstitüsü Massachusetts Institute of Technology ve Harvard, Cambridge ) Bu çalışmaya önceki katkılarından dolayı. Bu eser (için JF); Ragnar Söderberg Vakfı tarafından desteklenmiştir İsveç Araştırma Konseyi (için JF); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (için JF); İsveçli Vakfın Stratejik Araştırma (için JF); Åke Wiberg'ın kuruluşuna (J.F.); Marie Curie tümleştirme grant (için JF).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM without sodium pyruvateGE Life SciencesSH30022.01Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvateGE Life SciencesSH30243.01Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)Stem Cell Technologies9650Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyCloneGE Life SciencesSH30071.03HIGrowth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)Ge Life SciencesSV30010Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x)Thermo Fisher11140050SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x)GE Life SciencesSH30042.01Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF)Peprotech250-03Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3Peprotech213-13Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO)Peprotech100-64Added to reprogramming media
DexamethasoneSigma50-02-2  Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skinSigma9000-70-8 Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochlorideSigma3/9/3513Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Ge Life SciencesSH30850.03Used for washing steps
PolybreneMerckTR-1003-GInfection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µmMerckSLGP033RSUsed for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic SyringeBecton DickinsonSKU: 307736Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture DishCorning430167Cell culture
6-well plateFalcon10799541Cell culture
Jeweler Forceps #5Sklar66-7642Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris ScissorsSklar23-1149Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouseMiltenyi Biotec130-090-858For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec130-091-224For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cellsATCCCRL-3215retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco) Novus BiologicalsNBP2-29540retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1Cloned in-lab
pMX-Tal1Cloned in-lab
pMX-Lmo2Cloned in-lab
pMX-cMycCloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software Cytospin analysis software

Referanslar

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  2. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).
  3. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  4. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  5. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).
  6. Yu, B., et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).
  7. Hendry, C. E., et al. Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).
  8. Vierbuchen, T., Wernig, M. Direct lineage conversions: unnatural but useful. Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).
  9. Capellera-Garcia, S., Flygare, J. Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox. Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).
  10. Capellera-Garcia, S., et al. Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion. Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).
  11. Mahmoudi, S., Brunet, A. Aging and reprogramming: a two-way street. Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).
  12. Singbrant, S., et al. Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment. Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).
  13. Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage. Blood. 104 (3), 659-666 (2004).
  14. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  15. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
  16. Pulecio, J., et al. Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors. Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).
  17. Kurita, R., et al. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 142do rudan soyyeniden programlama artt ndantranskripsiyon fakt rlerigeli im biyolojisiGata1Tal1Lmo2c Myc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır