كريوسيكتيونينج واحد من أدمغة القوارض متعددة

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتجميد والفرع أنسجة المخ من الحيوانات متعددة كبديل للوقت لتجهيز العقول واحدة. هذا يقلل من تقلب المصبوغة أثناء إيمونوهيستوتشيميستري، ويقلل من الوقت كريوسيكتيونينج والتصوير.

Abstract

علم الأنسجة و immunohistochemistry هي الأساليب الروتينية من تحليل لتصور التشريح المجهري وترجمة البروتينات داخل الأنسجة البيولوجية. في علم الأعصاب، فضلا عن عدد كبير من المجالات العلمية الأخرى، تستخدم هذه التقنيات. يمكن أن يتم إيمونوهيستوتشيميستري على الشريحة التي شنت الأنسجة أو أقسام التعويم الحر. إعداد عينات محمولة على الشريحة عملية مكثفة وقت. البروتوكول التالي لتقنية، تسمى ميجابرين، تقليل الوقت الذي يستغرقه لانسجة المخ كريوسيكشن وجبل بنسبة تصل إلى 90% بالجمع بين العقول متعددة في كتلة واحدة مجمدة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب خفض التباين بين تلطيخ جولات، في دراسة histochemical كبيرة. وقد تم تحسين الأسلوب الحالي لاستخدام أنسجة الدماغ القوارض في تحليلات المناعي المتلقين للمعلومات؛ ومع ذلك، فإنه يمكن تطبيقها على مختلف الميادين العلمية التي تستخدم كريوسيكتيونينج.

Introduction

نقدم هنا، البروتوكول المتعلق بأسلوب رواية، الذي نسميه ميجابرين، البلدان المتقدمة النمو إلى كريوسيكشن العقول القوارض متعددة في نفس الوقت للإجراءات المناعي المتلقين للمعلومات. ميجابرين يسمح لإنتاج شرائح مفردة تحتوي على الأنسجة من الحيوانات متعددة. وقد تم تحسين هذا الأسلوب قطع المقاطع الاكليلية من 9 الفئران الكبار نصفي الكرة الأرضية، أو 5 العقول الكاملة الكبار، في أن واحد. ولذلك، هذا الأسلوب الأكثر قابلية للتطبيق في الدراسات المناعي كبيرة أو تحليلات أخرى للقيام بذلك في أنسجة المخ مثبتة على شريحة من مجموعة كبيرة من الحيوانات.

إيمونوهيستوتشيميستري ينطوي على استخدام أجسام مضادة محددة موجهة ضد البروتينات ذات الأهمية لفهم ووصف التعبير والتغيرات الخلوية في أنسجة محددة^1،،من²³. استخدام immunohistochemistry السائد في أبحاث علم الأعصاب، فيما بين التخصصات العلمية الأخرى، تساعد في فهم الدماغ⁴الخلوية والجزيئية. يمكن أن تكون دراسات واسعة النطاق تشمل العديد من الحيوانات وأجزاء الدماغ كل من الموارد والوقت المكثف. على هذا النحو، هناك أساس منطقي متعددة الأوجه وراء تطوير ميجابراين: لتقليل الوقت المستهلك كريوسيكتيونينج، المتصاعدة، وتلطيخ الأنسجة، بينما استخدام الكواشف أقل وبالتالي. وعلاوة على ذلك، القدرة على تبسيط العملية ووصمة عار العقول متعددة في نفس الجولة يساعد على التخفيف من حدة بعض التفاوت بين تلطيخ دفعات، حد من إيمونوهيستوتشيميستري³. وباﻹضافة إلى ذلك، تقطيع ميجابرين هو بديل توفير وقت لتقطيع أدمغة القوارض المجمدة فرادى ويسمح بمقارنة سريعة للأنسجة بين الحيوانات أو حتى معاملة الفئات بتقنيات الفحص المجهري.

Protocol

وقد تم تحسين تقنية ميجابرين استخدام العقول الجامعة وهيميسيكتيد من الذكور البالغين C57Bl6 الفئران⁵والأحداث سبراغ داولي الجرذان والفئران سبراغ داولي الكبار التي كانت ترانسكارديالي perfused مع 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) يتبع بارافورمالدهيد 4%⁶. ويمكن تحقيق نتائج مماثلة في السلالات الأخرى من الماوس وفار، وفي كلا الجنسين وفي مختلف الإعمار. الدراسة لتوليد البيانات لهذه المخطوطة تستخدم الفئران سبراغ داولي الأحداث ووافقت عليه لجنة الاستخدام ومؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة أريزونا، وكانت الحيوانات التجريبية يعتني بهم وفقا لدليل لرعاية واستخدام المختبرات ⁷من الحيوانات.

1-كريوبروتيكشن العقول Perfused

1. ترانسكارديال الناجحة التالية نضح⁶، جمع^6،الدماغ الكامل⁸ من الحيوانات وبعد إصلاح وضع في قنينة 25 مل من بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني عن 24 ساعة.
   تنبيه: بارافورمالدهيد مثبت أنسجة سامة؛ التعامل مع الرعاية. نقل بارافورمالدهيد إلى حاوية نفايات على وجه التحديد مسمى الذي يعرف به التركيز والحجم داخل غطاء الأبخرة كيميائية وثم الموظفين المدربين مخزن في النفاية الكيميائية مجلس الوزراء حتى يتم التخلص منها "السلامة الكيميائية" أو بشكل صحيح.
2. بعد مرور 24 ساعة، في غطاء دخان، إزالة العقول من بارافورمالدهيد 4% باستخدام ملعقة. نقل الدماغ في قنينة من حوالي 20 مل محلول السكروز 15% في 1 x تريس مخزنة المالحة (تبس) حتى الدماغ المصارف إلى أسفل القنينة (حوالي 24 ساعة).
3. وفي أعقاب ذلك، نقل الدماغ لقنينة من حوالي 20 مل محلول السكروز 30% في x TBS 1، حتى الدماغ المصارف إلى أسفل القنينة (حوالي ح 24 – 48).

2. تجميد الدماغ

1. ضع كوب زجاج 500 مل على سرير من الثلج الجاف دلو الجليد. صب الكأس الزجاج 300-400 مل إيسوبينتاني (الميثيل 2-البوتان).
2. درجة الحرارة من إيسوبينتاني تصل إلى ما بين-45 درجة مئوية و-50 درجة مئوية. ترصد عن كثب والحفاظ على درجة الحرارة هذه بحرارة، إبقائها ثابتة طوال فترة الإجراءات. ضمان أن تؤخذ قراءات درجة الحرارة من الشرق من الحل، ولا بينما لمس أسفل أو الجانب الكأس.
3. في benchtop، قم بملء المتاح تضمين العفن (انظر قائمة المواد) كامل حوالي 1/2 من "درجة الحرارة المثلى في قطع" (أكتوبر؛ انظر الجدول للمواد) مركب. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء في OCT. إذا كان هناك أي فقاعات الهواء بإزالتها مع ملعقة أو إبرة.
4. إزالة الدماغ الأولى من قنينة السكروز 30% مع ملعقة. عند هذه النقطة، أما تجميد كل العقول، أو هيميسيكت، اعتماداً على تصميم الدراسة.
   1. للعقول هيميسيكتيد، استخدام شفرة حلاقة جديدة لجعل قطع نظيفة من خلال الأنسجة لفصل في نصفي الكرة الأرضية. إذا كان غير مطلوب للدراسة، إزالة المخيخ والمصابيح شمي في هذه المرحلة. إذا كان المخيخ المسبق للدراسة، يقترح خفض مساحة مسطحة في نهاية الخلفي من الدماغ للمعونة في الدماغ في وضع الأمور في نصابها في القالب. إذا فقط يتطلب الدراسة أنسجة من منطقة محلية، يمكن استخدام مصفوفة الدماغ القوارض كتلة المخ استناداً إلى إحداثيات معروفة.
5. إعطاء العقول رقمي تسمية النظام. رسم تخطيطي كما هو مبين في الشكل 1. كتابة عدد الدماغ الأولى لتوضع في القالب ميجابرين في موقف 2، تاركاً الموقف 1 كمساحة فارغة للمساعدة في سرعة تحديد التوجه الذي تم تجميد العقول.
6. استخدام الملقط حادة أو الملقط، تلتقط الدماغ لوضعها في الموضع 1. توجيه الدماغ مع الجانب لقص الأولى التي تواجه صعودا. انخفاض استخدام الملقط تعديل موقفها حتى يقف الدماغ في OCT في الموقع المناسب، بشكل مستقل.
7. كرر الخطوات من 2.3-2.5 للعقول/نصفي الكرة المتبقية، ستجمد في المواقف 3 – 10. تجنب تحديد المواقع العقول/نصفي الكرة الأرضية في تخطيط متناظرة.
8. استعراض جميع العقول 9 في العفن ميجابراين. بمجرد العقول يقفون بشكل مستقل، منتصبا، وموجهاً توجيها صحيحاً في OCT (كما هو موضح في الشكل 2)، إضافة أكتوبر أكثر للقالب (حتى تغطي الجزء العلوي من العقول). مرة أخرى، تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء مرئياً في OCT.
9. استخدام الملقط عقد ركن العفن، ضمان الملقط لا تصبح جزئيا غارقة في OCT (الشكل 3A). الحرص على الحفاظ على مستوى العفن، انخفاض العفن في إيسوبينتاني (-45 درجة مئوية إلى-50 درجة مئوية) حيث أن الجزء السفلي الثالث من العفن هو المغمورة. اضغط هنا للسماح لأي فقاعات في OCT لترتفع إلى السطح، وبعيدا عن الأنسجة (الشكل 3B).
10. بعد 30 ق، أقل المغمورة العفن أسرة في إيسوبينتاني والإفراج عن الملقط، تاركاً في ميجابرين لمدة 3 دقائق على الأقل (الشكل 3). ضمان هذا العفن هو إبقاء المستوى، حتى تظل العقول تستقيم ومسافة واحدة (3D الشكل).
11. بعد 3 دقائق، مضمنة استخدام الملقط لإزالة القالب الذي يتضمن المجمدة، أكتوبر العقول (رقم 3E) من إيسوبينتاني.
12. على الفور، التفاف العفن ومحتوياته في رقائق الألومنيوم وتسميته بإعداد الحيوانات أو تحديد ميجابرين. اللمس ميجابرين المجمدة اقتصد قدر الإمكان لتجنب ذوبان الأنسجة.
13. هذا ميجابرين يمكن الآن نقل إلى ثلاجة-20 درجة مئوية وتخزينها لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: بروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا ويمكن تخزينها في ميجابرين مجمدة لحين كريوسيكتيونينج.

3-إعداد ميجابرين لتمزيقها على كريوستات

1. تعيين درجة حرارة كريوستات مجلس الوزراء-19 درجة مئوية. تأكد من أن يتم التوصل إلى درجة الحرارة هذه قبل المتابعة. في جميع أنحاء تمزيقها، ضمان بقاء مجلس الوزراء درجة الحرارة بين-18 درجة مئوية و-20 درجة مئوية.
2. تأخذ ميجابراين من الثلاجة-20 درجة مئوية، ووضعه في كريوستات. أيضا، ضع تشاك أبعاد الحجم المناسب، وفرشاة التلوين مقلوب رقيقة اثنين إلى كريوستات. ترك في ميجابراين وتشاك في كريوستات لمدة 15 دقيقة على الأقل للتوصل إلى درجة حرارة كريوستات.
3. على النحو المناسب تسمية الشرائح مع رقم التعريف ميجابرين ورقم الشريحة. وتكمن هذه الشرائح على شريحة أكثر دفئا (35 – 45 درجة مئوية).
4. بسط ميجابرين من رقائق الألومنيوم. استخدام شفرة الحلاقة لقص زوايا العفن السماح بسهولة إزالة كتلة أكتوبر من العفن (الشكل 4 أ) عمودياً.
5. الاستغناء عن طبقة رقيقة (حوالي 3 مم) من أكتوبر على تشاك.
6. بسرعة، مع الحد الأدنى من الاتصال بين الأصابع وفي أكتوبر، وضع في ميجابرين على تشاك، في الاتجاه المطلوب. يمكن أيضا استخدام الملقط الكبير لهذه الخطوة للحد من ذوبان الجليد. قبل أن تبدأ بالقسم، وإجازة في ميجابرين شنت تشاك في كريوستات لمدة 15 – 20 دقيقة للسماح OCT لتجميد تماما.
7. مرة واحدة قد جمدت الطبقة الأساس لاكتوبر، تطبيق طبقة سميكة مم 2 أكتوبر حول جانبي ميجابرين والسماح بتشغيل لأسفل من الجانبين على تشاك هذا. وهذا يساعد على تأمين ميجابرين لتشاك. ومرة أخرى، قبل المتابعة، ترك تشاك ميجابرين التي شنت في كريوستات لمدة 15 – 20 دقيقة للسماح OCT لتجميد.
8. استخدام شفرة حلاقة لإزالة أي أكتوبر الزائدة من الجانبين أو أسفل تشاك (الشكل 4 باء).

4-كريوسيكتيونينج ميجابرين

1. قبل البدء، تأكد من كوب يحتوي على مالا يقل عن 20 برنامج تلفزيوني 1 x مل موجوداً.
2. ضع تشاك، شنت مع ميجابراين، إلى رأس تشاك في كريوستات (الشكل 4 باء).
3. تعيين كريوستات قطع في السمك المطلوب. تم تحسين المنهجية الحالية ميكرومتر 10 إلى 50 ميكرومتر المقاطع.
4. تقليم OCT والأنسجة حسب الحاجة للوصول إلى منطقة الدماغ المطلوبة لجمع الأنسجة (الشكل 4).
5. عندما تصبح جاهزة لجمع الأنسجة وانخفاض لفة المضادة اللوحة ثم ضعه على المسرح ودورة مؤشر كريوستات لتأخذ مقطع واحد. ببطء رفع قبالة لوحة لفة المضادة، مع الحرص على أن ميجابرين مقطعة لا تعلق على لوحة لفة المضادة ولا تقع قبالة المرحلة رقم 4).
6. بلطف استخدام فرشاة التلوين لإلغاء المقطع ميجابرين حتى أنه هو الاستلقاء على مرحلة كريوستات (الشكل 5A). (إذا لزم الأمر،، أن يعقد في أكتوبر مسطحة باستخدام فرشاة التلوين منع المتداول).
7. إزالة شريحة من الشرائح الأكثر دفئا وتحوم الشريحة، الملصق أسفل، فوق المقطع ميجابرين في مرحلة السماح للقسم عصا على الشريحة.
8. بسرعة تطبيق قطره 1 x برنامج تلفزيوني لكل قسم الأنسجة على الشريحة ولا تسمح هذه لتجف حتى يكون قد نحي مسطحة (راجع الخطوة 4.9).
9. استخدام الرسام مقلوب غرامة انخفضت في برنامج تلفزيوني 1 x فرشاة خارج أي فقاعات في الأنسجة، وتتكشف الأنسجة حيث أنه هو الاستلقاء على الشريحة (الشكل 5 (ب)). الحرص على عدم تغيير موقف أجزاء الدماغ وهكذا تفقد الوضع النسبي للمقاطع الأخرى في الأنسجة. معالجة الأنسجة بعناية لتجنب الدموع. إبقاء أبواب الدماغ بعيداً عن الحواف الشريحة، مطلوب مساحة هامشية ساترة وتطبيق القلم PAP في بعض البروتوكولات المصبوغة.
10. ضع الشريحة مرة أخرى على الشريحة الأكثر دفئا والجافة عن 45 دقيقة الغطاء حسب الحاجة لمنع الغبار من تسوية في الأنسجة. وبمجرد جفاف، تخزين الشرائح في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

النتائج

نتيجة نهاية إيجابية لهذا الإجراء هي الأنسجة التي تقع الشقة على الشريحة، مع عدم وجود فقاعات أو الدموع، في الاتجاه الذي كانت قد جمدت. أقسام الأنسجة متباعدة بالتساوي عن بعضها البعض ويمكن تحديدها بسهولة بسبب موضع جيد للدماغ في OCT وتدوين جيدة كما يتبين في الشكل 1

Discussion

فإنه ينبغي النظر في أثناء هذا الإجراء أنه يجب باستمرار رصد درجة الحرارة في ميجابرين والمناطق المحيطة بها لمنع ذوبان الجليد وإعادة تجميد الأنسجة. المخ يمكن فقط إزالة من الثلاجة-20 درجة مئوية تصل إلى 3 مرات ككل مرة أنه لمس واليسار في كريوستات، مع درجة حرارة أدفأ متقلبة، الأنسجة يذوب وريفريزي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065