Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.

Résumé

L’histologie et l’immunohistochimie sont des méthodes de routine d’analyse afin de visualiser l’anatomie microscopique et de localiser des protéines dans les tissus biologiques. En neurosciences, comme une pléthore d’autres domaines scientifiques, ces techniques sont utilisées. Immunohistochemistry peut être fait sur le tissu de diapositives montées ou sections flottantes. Préparation des échantillons montés sur glissière est un processus intensif de temps. Le protocole suivant pour une technique, appelée le Megabrain, réduit le temps nécessaire aux tissus du cerveau cryosection et Mont jusqu'à 90 % en combinant plusieurs cerveaux en un seul bloc congelé. En outre, cette technique réduit la variabilité observée entre tours, dans une vaste étude histochimique de coloration. La technique actuelle a été optimisée pour l’utilisation de tissus cérébraux de rongeurs dans les analyses immunohistochimique en aval ; Toutefois, il peut être appliqué à différents champs scientifiques qui utilisent cryosectioning.

Introduction

Nous présentons ici le protocole pour une nouvelle méthode, que nous appelons Megabrain, mis au point pour cryosection plusieurs rongeurs brains simultanément de méthodes immunohistochimiques en aval. Un Megabrain permet la production de diapositives individuelles contenant des tissus de plusieurs animaux. Cette technique a été optimisée pour des coupes coronales de 9 hémisphères de rat adulte ou 5 adultes cerveau complet, en même temps. Par conséquent, cette technique est plus applicable dans les études immunohistochimiques grand ou autres analyses effectuées sur les tissus cérébraux monté sur glissière d’une importante cohorte d’animaux.

Immunohistochemistry implique l’utilisation d’anticorps spécifiques dirigés contre les protéines d’intérêt de comprendre et de caractériser leur expression et les changements cellulaires dans des tissus spécifiques^1,2,3. L’utilisation de l’immunohistochimie est répandue dans la recherche en neurosciences, entre autres disciplines scientifiques, en aidant à la compréhension moléculaire et cellulaire du cerveau⁴. Des études à grande échelle impliquant de nombreux animaux et sections du cerveau peuvent être les ressources et le temps intensif. Par conséquent, il y a une justification aux multiples facettes du développement de la Megabrain : pour réduire le temps passé à cryosectioning, de montage et de coloration des tissus, lors de l’utilisation par conséquent moins réactifs. En outre, la possibilité de rationaliser le processus et tacher les cerveaux multiples dans le même tour contribue à alléger la variabilité entre les lots, une limitation de l’immunohistochimie³de coloration. En outre, un Megabrain de sectionnement est une alternative de gain de temps au sectionnement des cerveaux de rongeurs congelés individuels et permet une comparaison rapide des tissus entre animaux ou même des groupes de traitement par des techniques de microscopie.

Protocole

La technique de Megabrain a été optimisée à l’aide de cerveaux ensemble et hemisected de mâles adultes du souris C57Bl6⁵et jeunes rats Sprague-Dawley rats Sprague-Dawley adultes qui ont été perfusé avec 1 x une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de transcardially par 4 % de paraformaldéhyde⁶. Des résultats similaires pouvant être effectuées dans les autres souches de souris et de rats, chez les deux sexes et à des âges différents. L’étude pour générer des données pour ce manuscrit utilisé de jeunes rats Sprague-Dawley et a été approuvé par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux institutionnels Université de l’Arizona, et les animaux de laboratoire ont été pris en charge selon le Guide pour les soins et l’utilisation de laboratoire Animaux⁷.

1. Cryoprotection des cerveaux perfusé

1. Suivant transcardial réussie perfusion⁶, recueillir le cerveau complet^6,8 , provenant d’animaux et fixer en plaçant dans un flacon de 25 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 24 h.
   ATTENTION : Paraformaldéhyde est un fixateur de tissu toxiques ; manipuler avec précaution. Transférer le paraformaldéhyde dans un conteneur à déchets spécifiquement marqué qui identifie sa concentration et volume à l’intérieur d’une hotte chimique et ensuite stocker dans le placard jusqu'à ce qu’éliminé par la sécurité des substances chimiques ou bien de déchets chimiques de personnel qualifié.
2. Après 24h, sous une hotte, supprimer cervelle de paraformaldéhyde à 4 % à l’aide d’une spatule. Transférer le cerveau dans un flacon de 20 mL environ de solution de saccharose de 15 % dans 1 x Tris salin (SCT) jusqu'à ce que le cerveau coule au fond de la cuvette (environ 24h).
3. Suite à cela, transférer le cerveau dans un flacon de 20 mL environ de solution de sucrose à 30 % en 1 x TBS, jusqu'à ce que le cerveau coule au fond de la cuvette (environ 24 à 48 h).

2. cerveau gel

1. Placer un bécher de verre de 500 mL sur un lit de glace dans un bac à glaçons. Verser 300 – 400 mL de l’isopentane (2 méthyl-butane) dans le bol de verre.
2. Laissez la température de l’isopentane rejoindre entre-45 ° C et -50 ° C. Suivre de près et maintenir cette température avec un thermomètre, gardant constante tout au long de la procédure. S’assurer que les lectures de température sont prises du milieu de la solution et ne pas en touchant le bas ou le côté du bécher.
3. Sur la table de travail, remplir un jetable enrobage moule (voir la liste des matériaux) environ 1/2 plein de température de coupe optimale (OCT ; voir Table des matières) composé. S’assurer qu’il n’y ait aucune bulle d’air dans l’OPO. S’il y a les bulles d’air, les enlever avec une spatule ou une aiguille.
4. Retirer le premier cerveau dans le flacon de 30 % de saccharose avec une spatule. À ce stade, soit geler tout de cerveaux ou hemisect, selon la conception de l’étude.
   1. Pour hemisected cerveaux, utiliser une lame de rasoir Neuve pour faire une coupe nette à travers le tissu pour séparer les hémisphères. Si ne pas nécessaire pour l’étude, retirer le cervelet et les bulbes olfactifs à ce stade. Si le cervelet est nécessaire pour l’étude, il est conseillé de couper une zone plate à l’extrémité postérieure du cerveau afin d’aider le cerveau à debout directement dans le moule. Si l’étude nécessite seulement des tissus d’une région localisée, une matrice de cerveau rongeurs permet de bloquer le cerveau selon des coordonnées connues.
5. Donner le cerveau numérique système de nommage. Dessiner un diagramme tel qu’illustré à la Figure 1. Écrire le numéro du premier cerveau à placer dans le moule Megabrain en position 2, laissant la position 1 comme un espace vide pour faciliter l’identification rapide de l’orientation dans laquelle les cerveaux ont été gelés.
6. À l’aide de forceps émoussé ou pince à épiler, ramasser le cerveau pour être placé en position 1. Orienter le cerveau avec le côté à couper première vers le haut. Inférieure du cerveau dans l’OPO à l’emplacement approprié, à l’aide de la pince à épiler pour ajuster sa position jusqu'à ce qu’il se tient indépendamment.
7. Répétez les étapes 2,3 et 2,5 pour les cerveaux/hémisphères restants devaient être gelés en positions 3 – 10. Évitez de placer des cerveaux/hémisphères dans une disposition symétrique.
8. Revoir toutes les 9 cerveaux dans le moule Megabrain. Une fois que les cerveaux sont debout indépendamment, debout et correctement orienté dans l’OPO (comme illustré à la Figure 2 b), ajouter plus de OCT au moule (jusqu'à ce que la partie supérieure du cerveau sont couverts). Encore une fois, s’assurer qu’il n’y ait aucune bulle d’air visible dans l’OPO.
9. Utiliser la pince pour tenir le coin du moule, assurant que la pince pas devenir partiellement submergée dans l’OPO (Figure 3 a). En prenant soin de maintenir le niveau de moule, abaissez le moule dans l’isopentane (-45 ° C à-50 ° C) afin que le fond troisième de la moule est submergé. Tenez-la ici pour permettre à toutes les bulles dans l’OPO à monter à la surface et éloigner les tissus (Figure 3 b).
10. Après 30 s, moins le moule entière dans l’isopentane et la libération de la pince, laissant le Megabrain submergé pendant au moins 3 min (Figure 3). S’assurer que ce moule est maintenue à niveau, donc cerveau reste debout et à égale distance (Figure 3D).
11. Après 3 min, utiliser la pince pour enlever le moule contenant la gelée, OCT incorporé cerveaux (Figure 3E) de l’isopentane.
12. Immédiatement, envelopper le moule et son contenu en papier d’aluminium et l’étiquette avec le nombre d’animaux ou d’identification Megabrain. Toucher le Megabrain congelé aussi parcimonieusement que possible pour éviter la fonte du tissu.
13. Cette Megabrain maintenant peut être transféré dans un congélateur à-20 ° C et stockée pendant au moins 24 h.
    NOTE : Protocole peut être suspendue ici et le Megabrain peut être stocké congelés jusqu'à ce que cryosectioning a lieu.

3. préparer le Megabrain pour la coupe sur le Cryostat

1. Régler la température du cabinet le cryostat à-19 ° C. Veillez à ce que cette température est atteinte avant de continuer. Tout au long de la section, assurez-vous que la température reste entre-18 ° C et -20 ° C.
2. Prendre la Megabrain du congélateur-20 ° C et placez-le dans le cryostat. Aussi, placez un mandrin des dimensions taille appropriée et deux pinceaux à pointe fine dans le cryostat. Laisser le Megabrain tant le mandrin dans le cryostat pendant au moins 15 minutes à la température du cryostat.
3. Convenablement les diapositives étiquette avec le numéro d’identification Megabrain et le numéro de la diapositive. Poser ces diapositives sur une lame plus chaude (35 à 45 ° C).
4. Déballer le Megabrain de la feuille d’aluminium. Utilisez une lame de rasoir pour couper verticalement les coins du moule pour permettre un retrait facile du bloc de OCT du moule (Figure 4 a).
5. Répartir une fine couche (environ 3 mm d’épaisseur) de OCT sur le mandrin.
6. Rapidement, avec un contact minimal entre les doigts et l’outil OPO, placez le Megabrain sur le mandrin, dans le sens désiré. Grande pince utilisable également pour cette étape afin de minimiser le dégel. Avant le début de l’article, laissez le Megabrain monté le mandrin dans le sens du cryostat pendant 15 à 20 min permettre l’OPO à geler complètement.
7. Une fois que la couche de base de OCT a gelé, appliquez une couche épaisse de 2 mm OCT autour des côtés de la Megabrain et laissez cela couler le long des côtés sur le mandrin. Ceci permet de garantir la Megabrain au mandrin. Encore une fois, avant de continuer, laissez le mandrin Megabrain monté dans le cryostat pendant 15 à 20 min permettre l’OPO à geler.
8. Utilisez une lame de rasoir pour retirer tout excédent OCT les côtés ou le fond du mandrin (Figure 4 b).

4. Cryosectioning le Megabrain

1. Avant de commencer, assurez-vous qu’un bécher contenant au moins 20 mL de PBS 1 x est accessible.
2. Positionner le mandrin, monté avec le Megabrain, dans la tête du mandrin sur le cryostat (Figure 4 b).
3. Définissez le cryostat à couper à l’épaisseur désirée. La méthodologie actuelle a été optimisée pour 10 µm à 50 µm sections.
4. Tailler l’OPO et tissus selon les besoins pour atteindre la région désirée de cerveau pour prélèvement tissulaire (Figure 4).
5. Lorsque vous êtes prêt à recueillir des tissus, abaissez la plaque anti-roll jusqu'à ce qu’elle repose sur la scène et tournez la poignée de cryostat à prendre une seule section. Soulevez lentement la plaque anti-roll, en prenant soin que le coupes Megabrain n’est pas fixé à la plaque anti-roll et ne tombe pas hors de la scène Figure 4).
6. Utilisez les pinceaux pour le dérouler la mèche de Megabrain jusqu'à ce qu’il est posé à plat sur la scène du cryostat (Figure 5 a). (Le cas échéant, tenir l’OPO avec les pinceaux pour éviter de rouler à plat).
7. Retirer la glissière de lame plus chaud et planer la diapositive, face imprimée vers le bas, sur le tronçon de Megabrain sur la scène lui permettant du coller à la diapositive.
8. Rapidement une goûte de PBS 1 x à chaque section de tissu sur la lame et ne permettent pas à sécher jusqu'à ce qu’ils ont été fait avec plats (voir étape 4,9).
9. Utilisez un pinceau à pointe fin trempé dans du PBS 1 x à brosser toutes les bulles dans les tissus et déplier le tissu, donc c’est bien à plat sur la lame (Figure 5 b). Prendre soin de ne pas changer la position des sections cerveau et perdent ainsi la position relative des autres sections de tissu. Manipuler les tissus avec soin pour éviter les déchirures. Garder des sections de cerveau des bords de la diapositive, comme espace périphérique est requis pour l’application de stylo PAP dans certains protocoles de coloration et lamelle couvre-objet.
10. Placer la lame sur la diapositive plus chaud et sec, pendant 45 min. au besoin, pour empêcher la poussière de se déposer sur le tissu de la couverture. Une fois sec, conserver les diapositives d’à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.

Résultats

Un résultat positif à cette procédure est le tissu qui se trouve à plat sur la diapositive, sans bulles ni les larmes, dans le sens où ils ont été gelés. Des sections de tissu sont équidistants apart et facilement identifiable en raison du bon placement du cerveau dans l’OPO et bonne notation tel que démontré dans la Figure 1. En supposant que le tissu cérébral ont été recueilli auprès des animaux du même âge, et que le tissu a été corre...

Discussion

Il devrait être considéré au cours de cette procédure que la température de la Megabrain et ses environs doit être constamment surveillée pour éviter la décongélation et la recongélation des tissus. Le cerveau seulement s’éliminent du congélateur-20 ° C vers le haut à 3 fois comme chaque fois qu’il est touché et gauche dans le cryostat, avec une température plus chaude fluctuant, le tissu dégèle et regèle, causant une gelée comme texture et tissu anormal intégrité¹⁰. Par...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065