Одновременно Cryosectioning нескольких грызунов мозги

Резюме

Здесь мы представляем протокол к замораживанию и раздел мозговой ткани из нескольких животных как экономия времени альтернатива для обработки одного мозги. Это уменьшает окрашивание изменчивость во время иммуногистохимии и уменьшает время cryosectioning и томографии.

Аннотация

Обычные методы анализа для визуализации микроскопической анатомии и Локализация белков в биологической ткани гистологии и иммуногистохимии. В неврологии, а также множество других научных областях используются эти методы. Иммуногистохимия может быть сделано на слайд монтируется ткани или свободно плавающего секций. Подготовка образцов слайда монтируется это время интенсивного процесса. Следующий протокол для метод, называемый Megabrain, сократить время, необходимое для cryosection и горе ткани мозга до 90% путем объединения нескольких мозги в единый блок замороженные. Кроме того этот метод снижение изменчивости между пятнать раундов, в большой гистохимических исследований. Текущий метод был оптимизирован для использования грызунов мозговой ткани в течению Иммуногистохимический анализ; Однако она может применяться в различных научных областях, использующих cryosectioning.

Введение

Здесь мы представляем протокол для метода роман, который мы называем Megabrain, разработан для cryosection, несколько грызунов мозги одновременно течению иммуногистохимических процедур. Megabrain позволяет для производства одного слайдов, содержащих ткани от нескольких животных. Эта техника была оптимизирована для вырезать корональных разделы из 9 взрослых крыс полушарий, или 5 взрослых полное мозги, одновременно. Таким образом методика является наиболее применимым в больших иммуногистохимические исследования или другие анализы, сделали на ткани головного мозга, слайд установлен с большой когорты животных.

Иммуногистохимия предполагает использование специфических антител, направленные против протеинов интереса для понимания и характеризуют их выражения и клеточные изменения в конкретных тканей^1,2,3. Использование иммуногистохимия преобладает в неврологии исследований, среди других научных дисциплин, пособничество в клеточном и молекулярном понимания мозга⁴. Крупномасштабные исследования, с участием многих животных и секции мозга может быть как ресурсов, так и во время интенсивного. Таким образом, является многогранной обоснование разработки Megabrain: сократить время провел cryosectioning, монтаж и окрашивание ткани, а следовательно с использованием менее реагентов. Кроме того возможность рационализировать процесс и пятно несколько мозги в том же раунде помогает облегчить некоторые из изменчивость между пятнать пакетов, ограничение иммуногистохимия³. Кроме того секционирование Megabrain является экономия времени альтернативой секционирование отдельных замороженных грызунов мозги и позволяет для быстрого сравнения ткани между животных или даже группы лечения методами микроскопии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Megabrain техника была оптимизирована с помощью состава и hemisected мозги от мужчины взрослых мышей C57Bl6⁵, несовершеннолетних крысах Sprague-Dawley и взрослых крыс Sprague-Dawley, которые были transcardially, увлажненную с 1 x фосфатный буфер (PBS) после параформальдегида 4%⁶. Аналогичные результаты может осуществляться в других штаммов мыши и крысы, у обоих полов и в разном возрасте. Исследование для создания данных для этого манускрипта используется несовершеннолетних крысах Sprague-Dawley и был одобрен университета штата Аризона институционального ухода за животными и использования Комитетом, и были заботятся согласно руководство для ухода и использования лабораторных экспериментальных животных ⁷животных.

1. криозащиты перфузии мозга

1. После успешного transcardial перфузии⁶, собирать полный мозга^6,8 от животных и пост исправить путем размещения в 25 мл флакон параформальдегида 4% в PBS на 24 часа.
   Предупреждение: Параформальдегида является токсичным ткани фиксатором; обращаться с осторожностью. Передача параформальдегида в специально обозначенных контейнер для отходов, который идентифицирует его концентрации и объема внутри Химический вытяжной шкаф и затем хранить в химических отходов, кабинета до утилизации химической безопасности или должным образом подготовленного персонала.
2. По истечении 24 h в Зонта, удалите мозги из параформальдегида 4%, с помощью шпателя. Передача мозга во флакон примерно 20 мл раствора 15% сахарозы в 1 x трис амортизированное saline (TBS) до тех пор, пока мозг опускается на дно флакона (примерно 24 h).
3. После этого передать мозг флакон примерно 20 мл раствора 30% сахарозы в 1 x TBS, до тех пор, пока мозг опускается на дно флакона (около 24-48 ч).

2. мозг замораживания

1. Место стеклянный стакан 500 мл на ложе из сухого льда в ведёрке со льдом. Налейте в стакан стеклянный 300 – 400 мл изопентана (2 метил Бутан).
2. Разрешить температуры изопентана до-45 ° C до-50 ° C. Внимательно контролировать и поддерживать этот диапазон температур с помощью термометра, сохраняя его постоянной на протяжении всей процедуры. Убедитесь, что показания температуры взяты из середины решения, а не дотрагиваться до нижней и боковой стакан.
3. На benchtop, заполнить одноразовые, встраивание формы (см. перечень материалов) примерно 1/2 полный оптимальной температуры вырезывания (Окт; см. Таблицу материалы) соединения. Убедитесь, что есть нет пузырьков воздуха в центре развертывания Office. Если есть любые пузыри воздуха удалить их с помощью шпателя или иглы.
4. Удалите первый мозг из флакона 30% сахарозы с помощью шпателя. На данный момент либо заморозить мозг полностью или hemisect, в зависимости от дизайна исследования.
   1. Для hemisected мозги используйте новые лезвия бритвы сделать чистая прорезать ткани, чтобы отделить полушарий. Если не требуется для исследования, удалите мозжечка и обонятельные луковицы на данном этапе. Если мозжечка необходим для исследования, предлагается сократить плоской области в конце заднего мозга, чтобы помочь мозга в стоя прямо в форме. Если исследование требует только ткани из локализованных региона, матрицу грызунов мозга может использоваться для блокирования мозга, основанные на известных координат.
5. Дать мозги Числовое именование системы. Нарисуйте диаграмму, как показано на рисунке 1. Напишите номер первого мозга, чтобы быть помещены в Megabrain плесень в позиции 2, оставив позиции 1 как пустое пространство, чтобы помочь в быстрой идентификации ориентации, в которой были заморожены мозги.
6. Использование тупой щипцами или пинцетом, подобрать мозг быть помещены в позиции 1. Ориент мозга с в сторону, чтобы вырезать первый вверх. Ниже мозга в центре развертывания Office в соответствующее место, используя пинцет скорректировать свою позицию до тех пор, пока он стоит самостоятельно.
7. Повторите шаги 2.3-2.5 для оставшихся мозги/полушарий быть заморожены в позициях 3 – 10. Избегайте позиционирования мозги/полушарий в макете симметрично.
8. Просмотрите все 9 мозги в Megabrain форму. Как только мозги стоят самостоятельно, вертикально и правильно ориентированных в центре развертывания Office (как показано на рисунке 2B), добавьте больше OCT плесень (до тех пор, пока в верхней части мозги покрыты). Опять же убедитесь, что есть нет видимых воздушных пузырьков в центре развертывания Office.
9. Используйте щипцы провести углу формы, обеспечивая щипцы не стать частично погруженным в центре развертывания Office (рис. 3A). Будьте осторожны сохранить уровень плесень, опустите плесень в изопентана (-45 ° C до-50 ° C) так что нижней трети погружен прессформу. Держите разрешить любые пузыри в центре развертывания Office, чтобы подняться на поверхность и от ткани (рис. 3B).
10. После 30 s, меньше всего плесень в изопентана и освобождения от щипцы, оставляя Megabrain погружения для по крайней мере 3 мин (рис. 3 c). Убедитесь, что плесень уровне, поэтому мозг остаются вертикально, так и на равном расстоянии (рис. 3D).
11. После 3 минут используйте щипцы для удаления плесени, содержащий замороженные, OCT встроенных мозги (Рисунок 3E) из изопентана.
12. Сразу же оберните прессформы и его содержимое в алюминиевой фольги и маркировать его с поголовья или Megabrain идентификации. Как можно избежать оттаивания тканей скупо сенсорных замороженных Megabrain.
13. Этот Megabrain может теперь переведен в морозильной камере-20 ° C и хранить в течение как минимум 24 часа.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и Megabrain может храниться до cryosectioning занимает место.

3. Подготовка Megabrain для разрезания на криостат

1. Установите кабинета температуру криостата до-19 ° C. Убедитесь, что эта температура достигается прежде чем продолжить. На протяжении секционирование, гарантировать шкафа температуры от-18 ° C до -20 ° C.
2. Возьмите Megabrain из морозильной камеры-20 ° C и поместите его в криостата. Кроме того место Чак соответствующие размеры и два тонким наконечником кисти в криостата. Оставьте Megabrain и патрон в криостат для по крайней мере 15 минут прийти к температуре криостата.
3. Надлежащим образом ярлык слайды с Megabrain идентификационный номер и номер слайда. Положите эти слайды на слайде с подогревом (35 – 45 ° C).
4. Развертки Megabrain из алюминиевой фольги. Используйте лезвие вертикально срезать углы формы позволяют легко удаления блока октября от плесени (рис. 4A).
5. Распределить тонким слоем (толщиной около 3 мм) октября на патрон.
6. Быстро с минимальным контактом между пальцами и OCT, место Megabrain на патрон, в желаемой ориентации. Большие щипцы могут также использоваться для этого шага для сведения к минимуму оттаивания. Перед началом раздел, оставьте Megabrain установлен патрон в криостат для 15-20 минут позволить OCT заморозить полностью.
7. После того, как замороженные базовый слой OCT, применять слоем толщиной 2 мм OCT вокруг стороны Megabrain и позволить, чтобы бежать вниз с сторон на патрон это. Это помогает защитить Megabrain в патрон. Опять же прежде чем продолжить, оставьте Чак Megabrain смонтированы в криостат для 15-20 минут позволить OCT заморозить.
8. Для удаления любой избыток октября от стороны или нижней части патрона (рис. 4B) используйте лезвием бритвы.

4. Cryosectioning Megabrain

1. Перед началом, убедитесь, что доступен стакан, содержащий по меньшей мере 20 мл ПБС.
2. Расположите Чак, монтируется с Megabrain, в зажимную головку на криостата (рис. 4В).
3. Установите криостата Cut на желаемую толщину. Нынешняя методология была оптимизирована для 10 мкм до 50 мкм секций.
4. Трим OCT и ткани, необходимых для достижения желаемого мозг региона для коллекции ткани (рис. 4 c).
5. Когда будете готовы собирать ткани, Нижняя пластина уголка, до тех пор, пока он лежит на сцене и поверните ручку криостата принять одну секцию. Медленно поднимите пластину уголка, стараясь секционного Megabrain не присоединен к пластина уголка и не упасть этапе Рисунок 4 d).
6. Аккуратно используйте кисти раскатать в Megabrain разделе до тех пор, пока он лежит плашмя на сцене криостата (Рисунок 5A). (При необходимости, провести OCT плоская, с помощью кисти для предотвращения прокатки).
7. Удалить слайд из слайда с подогревом и наведите слайд, этикеткой вниз, над Megabrain на сцене, позволяя в разделе Вставить на слайд.
8. Быстро применить капли ПБС к каждому разделу ткани на слайде и не позволяют эти высохнуть до тех пор, пока они были чистили плоский (см. шаг 4.9).
9. Использование тонкой наконечником кистью, смоченной в однократном ПБС кисть из любые пузыри в ткани и разворачиваться ткани, так что он лежит плашмя на слайде (Рисунок 5B). Заботиться, чтобы не изменять положение секции мозга и таким образом потерять относительное положение в других разделах ткани. Манипулировать ткани с осторожностью, чтобы избежать слезы. Держите секции мозга от края слайда, как периферийные пространство требуется для coverslip и пап перо приложения в некоторых пятная протоколы.
10. Поместите слайд обратно на слайд, теплым и сухим для 45 мин покрытие для предотвращения пыли от урегулирования на ткани. После высыхания, храните слайды при температуре-80 ° C до дальнейшего использования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Положительный конечный результат этой процедуры является ткань, которая лежит плашмя на слайде, без пузырей или слезы, в ориентации, в котором они были заморожены. Разделах ткани равномерно распределены отдельно и легко идентифицировать благодаря хорошее размещение ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Во время этой процедуры следует рассматривать, что температура Megabrain и его окрестностях должен постоянно контролироваться предотвратить Размораживание и повторное замораживание ткани. Мозг можно только удалить из морозильной камеры-20 ° C до до 3 раза как каждый раз, когда он коснулся и ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065