Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzufrieren und Abschnitt Gehirngewebe von mehreren Tieren als eine zeitsparende Alternative zur Bearbeitung einzelner Gehirne. Dies senkt die Färbung Variabilität bei Immunohistochemistry und reduziert Zeit Kryoschneiden und Imaging.

Zusammenfassung

Histologie und Immunhistochemie sind Routineverfahren der Analyse zu visualisieren mikroskopische Anatomie und Proteine in biologischen Geweben zu lokalisieren. In Neurowissenschaften, sowie eine Fülle von anderen wissenschaftlichen Bereichen sind diese Techniken verwendet. Immunohistochemistry kann auf Schlitten montiert Gewebe- oder frei schwebenden Abschnitte erfolgen. Probenvorbereitung von Folie montiert, ist eine zeitintensive Prozess. Das folgende Protokoll für eine Technik, genannt die Megabrain reduziert den Zeitaufwand für Cryosection und Mount Hirngewebe um bis zu 90 % durch die Kombination mehrerer Gehirne in einem gefrorenen Block. Darüber hinaus reduziert diese Technik Variabilität zwischen runden, in einer großen Studie histochemische Färbung gesehen. Die aktuelle Technik wurde optimiert für die Verwendung von Nagetier Hirngewebe in nachgeschalteten immunhistochemische Analysen; jedoch kann es zu verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen angewendet werden, die Kryoschneiden verwenden.

Einleitung

Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für eine neuartige Methode, die wir Megabrain nennen, zu Cryosection mehrere Nagetier gleichzeitig für nachgeschaltete immunhistochemische Verfahren Gehirne entwickelt. Ein Megabrain ermöglicht die Herstellung der einzelnen Folien mit Gewebe aus mehreren Tieren. Diese Technik wurde optimiert, um koronalen Abschnitte aus 9 Erwachsene Ratte Hemisphären oder 5 Erwachsene voller Gehirne gleichzeitig geschnitten. Daher ist die Technik am ehesten zutreffenden in großen immunhistochemische Studien oder andere Analysen auf Schlitten montiert Hirngewebe aus einer großen Kohorte von Tieren gemacht.

Immunohistochemistry beinhaltet die Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen Proteine des Interesses zu verstehen und zu charakterisieren ihren Ausdruck und zelluläre Veränderungen in bestimmten Gewebe^1,2,3. Die Verwendung von Immunohistochemistry ist in der neurowissenschaftlichen Forschung, unter anderen wissenschaftlichen Disziplinen, Beihilfe bei der zellulären und molekularen Verständnis des Gehirns⁴verbreitet. Groß angelegte Studien, an denen viele Tiere und Gehirn Abschnitte können Ressourcen- und zeitintensiv sein. Als solche gibt es eine vielfältige Beweggründe für die Entwicklung der Megabrain: Verkürzung verbrachte Kryoschneiden, Montage und Färbung Gewebe, wobei folglich weniger Reagenzien. Darüber hinaus die Möglichkeit, den Prozess zu optimieren und Flecken auf mehrere Köpfe in der gleichen Runde hilft, einige der Variabilität zwischen Chargen, eine Beschränkung von Immunohistochemistry³Färbung zu lindern. Darüber hinaus ein Megabrain-Schnitt ist eine zeitsparende Alternative zum Schneiden einzelne gefrorene Nager Gehirne und ermöglicht schnellen Vergleich der Gewebe zwischen Tieren oder sogar Behandlungsgruppen durch mikroskopiertechniken.

Protokoll

Die Megabrain-Technik wurde optimiert, mit ganzen und Hemisected Gehirne von männlichen Erwachsenen C57Bl6 Mäuse⁵, juvenile Sprague-Dawley Ratten und Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten, die Transcardially durchströmt mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt waren von 4 % Paraformaldehyd⁶. Ähnliche Ergebnisse können in andere Stämme von Maus und Ratte, bei beiden Geschlechtern und in den verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Die Studie zur Datengenerierung für diese Handschrift juvenile Sprague-Dawley Ratten verwendet und wurde von der University of Arizona institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt, und Versuchstieren wurden für die Zuerkennung der Leitfaden für die Pflege und Nutzung des Labor betreut Tiere-⁷.

1. Cryoprotection der PERFUNDIERTEN Gehirne

1. Folgende erfolgreiche Transcardial Perfusion⁶, sammeln die vollständige Gehirn^6,8 von Tieren und Post-zu beheben, indem man in ein 25 mL-Fläschchen mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 24 h.
   Achtung: Paraformaldehyd ist eine giftige Gewebe Fixiermittel; mit Vorsicht handhaben. Übertragen von Paraformaldehyd in einen speziell gekennzeichneten Abfallbehälter, der seine Konzentration und Volumen innerhalb einer chemischen Dampfhaube identifiziert und dann laden in der Chemieabfall Kabinett bis Chemikaliensicherheit oder ordnungsgemäß entsorgt geschultes Personal.
2. Nach 24 Stunden, in einer Dampfhaube verstrichen ist entfernen Sie Gehirne aus 4 % Paraformaldehyd mit einem Spachtel. Übertragen Sie das Gehirn in ein Fläschchen mit ca. 20 mL 15 % Saccharoselösung in 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) bis Gehirn auf den Boden des Röhrchens (ca. 24 h sinkt).
3. Im Anschluss daran übertragen Sie das Gehirn auf ein Fläschchen mit ca. 20 mL 30 % Saccharoselösung in 1 X TBS, bis das Gehirn auf den Boden des Röhrchens (ca. 24 – 48 h) sinkt.

2. Gehirn Einfrieren

1. Legen Sie eine 500 mL-Becherglas auf einem Bett von Trockeneis in einem Eiskübel. Gießen Sie 300 – 400 mL Isopentane (2-Methyl-Butan) in das Becherglas.
2. Können Sie die Temperatur des Isopentane-45 ° C bis-50 ° c erreichen Genau zu überwachen Sie und pflegen Sie dieses Temperaturbereichs mit einem Thermometer, Konstanthaltung während des Verfahrens. Sicherstellen Sie, dass die Temperaturwerte aus der Mitte der Lösung und nicht beim Berühren der unteren oder Seite des Bechers entnommen werden.
3. Auf der Tischplatte, füllen ein Einweg Form einbetten (siehe Materialliste) ca. 1/2 voller optimale Arbeitstemperatur (Okt; siehe Tabelle of Materials) Compound. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen im Office-Anpassungstool gibt. Gibt es entfernen Luftblasen sie mit einem Spatel oder einer Nadel.
4. Entfernen Sie das erste Gehirn aus der Durchstechflasche von 30 % Saccharose mit einem Spatel. An dieser Stelle Einfrieren entweder Gehirne ganz oder Hemisect, je nach Design der Studie.
   1. Verwenden Sie um Hemisected Köpfe eine neue Rasierklinge um einen sauberen Schnitt durch das Gewebe, die Hemisphären zu trennen. Wenn nicht für die Untersuchung benötigt, entfernen Sie das Kleinhirn und der olfaktorischen Birnen in diesem Stadium. Wenn das Kleinhirn für die Untersuchung erforderlich ist, wird vorgeschlagen, um eine Ebene Fläche am hinteren Ende des Gehirns zugunsten des Gehirns im stehen direkt im Werkzeug zu schneiden. Wenn die Studie nur Gewebe aus einer lokalisierten Region erforderlich ist, kann eine Nagetier Gehirn Matrix verwendet werden, basierte auf bekannten Koordinaten Gehirn blockieren.
5. Geben Sie einen numerischen Benennungssystem Gehirne. Zeichnen Sie ein Diagramm, wie in Abbildung 1dargestellt. Schreiben Sie die Nummer des ersten Gehirns platziert werden, in der Form von Megabrain in Position 2 Position 1 zu verlassen, als ein leerer Raum, in schnelle Identifizierung der Orientierung zu helfen, in dem die Gehirn eingefroren wurden.
6. Mit stumpfen Zange oder Pinzette, Abholung des Gehirns auf Position 1 gestellt werden. Orientieren Sie das Gehirn mit der Seite geschnitten werden erste nach oben. Senken Sie das Gehirn in das Office-Anpassungstool an der entsprechenden Stelle mit der Pinzette um seine Position anzupassen, bis es selbstständig steht.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,5 für die restlichen Gehirn/Hemisphären in 3 – 10 Positionen eingefroren werden. Sollten Sie sich Gehirne/Hemisphären in eine symmetrische Anordnung.
8. Überprüfen Sie alle 9 Gehirne in der Megabrain-Form. Sobald die Gehirn unabhängig, aufrecht und richtig herum im Office-Anpassungstool (siehe Abb. 2 b) stehen, die Form fügen Sie mehr OCT hinzu, (bis oben auf die Köpfe fallen). Wieder, sicherzustellen Sie, dass es keine sichtbaren Luftblasen im Office-Anpassungstool.
9. Verwenden Sie die Zange um die Ecke des Werkzeugs, sicherzustellen, dass die Zange nicht im Office-Anpassungstool (Abbildung 3A) teilweise untergetaucht werden zu halten. Achten Sie darauf, die Schimmel-Niveau zu halten senken die Form in der Isopentane (-45 ° C bis-50 ° C) so dass unten der dritten Form ist untergetaucht. Halten Sie es hier Luftblasen im Office-Anpassungstool zu steigen an die Oberfläche und entfernt das Gewebe (Abb. 3 b) zu ermöglichen.
10. Nach 30 s, unten die ganze Form in die Isopentane und Entlassung aus der Zange, verlassen die Megabrain unter für mindestens 3 min (Abbildung 3 Wasser). Stellen Sie sicher, dass Schimmel ist Ebene gehalten, damit die Gehirne bleiben aufrecht und äquidistanten (Abbildung 3D).
11. Nach 3 min eingebettet Gebrauch der Zange zu entfernen den Schimmel mit dem gefrorenen, OCT Gehirne (Abbildung 3E) aus der Isopentane.
12. Sofort, wickeln Sie die Form und den Inhalt in Alufolie und beschriften Sie sie mit der Tierzahlen oder Megabrain Identifikation. Berühren Sie die gefrorenen Megabrain so sparsam wie möglich zu vermeiden, Auftauen des Gewebes.
13. Diese Megabrain kann jetzt in einem Gefrierschrank-20 ° C übertragen und dort gespeichert für ein Minimum von 24 h.
    Hinweis: Protokoll kann hier angehalten und die Megabrain kann gespeichert werden eingefroren, bis Kryoschneiden stattfindet.

3. Vorbereiten der Megabrain-Schnitt auf der Kryostat

1. Legen Sie die schranktemperatur Kryostaten bis-19 ° C. Stellen Sie sicher, dass diese Temperatur erreicht ist, bevor Sie fortfahren. Schneiden, sicherstellen Sie, dass die schranktemperatur zwischen-18 ° C und-20 ° C bleibt.
2. Nehmen Sie die Megabrain aus dem Tiefkühler-20 ° C und legen Sie sie in den Kryostaten. Legen Sie auch ein Futter von den entsprechenden Abmessungen und zwei dünnen Spitzen Pinsel in Kryostaten. Lassen Sie die Megabrain und das Bohrfutter im Kryostaten für mindestens 15 Minuten auf die Temperatur des Kryostaten kommen.
3. Kennzeichnen Sie Folien mit Megabrain-ID-Nummer und die Nummer der Folie entsprechend. Legen Sie die Folien auf einer Folie wärmer (35 – 45 ° C).
4. Packen Sie die Megabrain aus der Alufolie. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um vertikal schneiden Sie die Ecken des Schimmels erlauben einfache Entfernung des Blocks Okt. aus der Form (Abb. 4A).
5. Eine dünne Schicht (ca. 3 mm dick) Okt. auf das Futter zu verzichten.
6. Platzieren Sie schnell, mit minimalen Kontakt zwischen Fingern und das Office-Anpassungstool, die Megabrain auf dem Futter in der gewünschten Ausrichtung. Große Zange können auch für diesen Schritt verwendet werden, um Auftauen zu minimieren. Vor Beginn der Abschnitt, verlassen die Megabrain montiert Chuck in den Kryostaten für 15-20 min zum Office-Anpassungstool komplett gefrieren lassen.
7. Sobald die Basisschicht Okt. eingefroren hat, gelten eine 2 mm dicke Schicht OCT um die Seiten des dem Megabrain und zulassen, dass dies von den Seiten auf das Spannfutter heruntergekommen. Dies sichert die Megabrain an das Futter. Wieder, bevor Sie fortfahren, verlassen Sie die Megabrain montiert Chuck in den Kryostaten für 15-20 min zum Office-Anpassungstool zu frieren lassen.
8. Jede überschüssige OCT von Seiten oder unten des Futters (Abbildung 4 b) entfernen Sie mit einer Rasierklinge.

(4) Kryoschneiden die Megabrain

1. Bevor Sie beginnen, zu gewährleisten, dass ein Becher mit mindestens 20 mL 1 X PBS zugänglich ist.
2. Positionieren Sie das Spannfutter montiert mit Megabrain, in der Futter-Kopf auf der Kryostat (Abbildung 4 b).
3. Festlegen der Kryostat schneiden auf die gewünschte Dicke. Die aktuelle Methode ist für 10 µm bis 50 µm Abschnitte optimiert worden.
4. Schneiden Sie das Office-Anpassungstool und Gewebe wie notwendig, um die gewünschte Gehirnregion für Gewebe-Sammlung (Abbildung 4) zu erreichen.
5. Wenn Sie bereit sind, Gewebe zu sammeln, senken Sie die Anti-Rolle-Platte ab, bis es auf der Bühne ruht und drehen Sie den Kryostaten Griff um einen Abschnitt zu nehmen. Heben Sie langsam die Anti-Roll-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die geschnittenen Megabrain nicht auf die Anti-Roll-Platte befestigt ist und nicht von der Bühne Abbildung 4 fällt).
6. Verwenden Sie die Pinsel sanft Abschnitt Megabrain abrollen, bis sie flach auf der Kryostat-Bühne (Abbildung 5A) liegt. (Bei Bedarf halten Sie das Office-Anpassungstool flach mit dem Pinsel um Walzen zu verhindern).
7. Entfernen Sie die Folie von Folie wärmer und zeigen Sie die Folie, Label-Seite nach unten, über die Megabrain-Abschnitt auf der Bühne, so dass Abschnitt, um an der Folie kleben.
8. Schnell geben Sie einen Tropfen von 1 X PBS zu jedem Gewebe-Abschnitt auf der Folie und lassen Sie sich nicht diese zu trocknen, bis sie flach gereinigt worden sind (siehe Schritt 4,9).
9. Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel eingetaucht in 1 X PBS ausbürsten Bläschen im Gewebe und das Gewebe zu entfalten, so dass sie flach auf der Folie (Abbildung 5 b) liegt. Achten Sie darauf, nicht ändern Sie die Position der Gehirn-Abschnitte und verlieren dadurch die relative Position zu den anderen Abschnitten der Gewebe. Bearbeiten Sie das Gewebe mit Sorgfalt um Tränen zu vermeiden. Halten Sie Gehirn Bereiche Weg von den Rändern der Folie, wie peripheren Raum für ein Deckglas und PAP-Stift Anwendung in einigen Färbung Protokolle erforderlich ist.
10. Legen Sie die Folie wieder auf der Folie, wärmeren und trockenen für 45 min. Abdeckung je nach Bedarf zu verhindern, dass Staub absetzen auf das Gewebe. Nach dem Trocknen, speichern Sie die Folien bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

Ergebnisse

Eine positive Bilanz für diese Prozedur ist Gewebe, das liegt flach auf der Folie, ohne Bläschen oder Risse in der Ausrichtung, in der sie eingefroren waren. Gewebeschnitte werden gleichmäßig verteilt auseinander und leicht erkennbar durch gute Platzierung des Gehirns im Office-Anpassungstool und gute Schreibweise wie in Abbildung 1dargestellt. Vorausgesetzt, dass das Hirngewebe von Tieren in einem ähnlichen Alter gesammelt wurde, und das Gewebe wurde im...

Diskussion

Während dieses Vorgangs zu berücksichtigen, dass die Temperatur der Megabrain und seine Umgebung ständig überwacht werden muss, um zu verhindern, Auftauen und wieder einfrieren des Gewebes. Das Gehirn kann nur aus dem Tiefkühler-20 ° C bis zu 3 mal als entfernt werden jedes Mal, wenn es berührt wird und Links in den Kryostaten mit wärmeren schwankende Temperaturen, das Gewebe auftaut und gefriert, wodurch eine Gelee wie Textur und krankhaftes Gewebe Integrität¹⁰. Daher ist es optimal, um ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065