Cryosectioning simultanea di più cervelli roditore

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per congelare e sezione di tessuto cerebrale da più animali come alternativa ad alta produttività per singoli cervelli di elaborazione. Questo riduce la variabilità di colorazione durante immunohistochemistry e imaging e tempo cryosectioning.

Abstract

Istologia e immunohistochemistry sono metodi di routine di analisi per visualizzare l'anatomia microscopica e localizzare le proteine all'interno dei tessuti biologici. In neuroscienze, così come una pletora di altri campi scientifici, queste tecniche sono utilizzate. Immunohistochemistry può essere fatto su tessuto scivolo montato o sezioni digalleggiante. Preparazione dei campioni montata è un processo intensivo di tempo. Il seguente protocollo per una tecnica, denominata Megabrain, ridotto il tempo necessario al tessuto cerebrale donatrici e Monte fino al 90% combinando più cervelli in un unico blocco congelato. Inoltre, questa tecnica ridotta variabilità visto tra turni, in un grande studio istochimico di colorazione. La tecnica attuale è stata ottimizzata per l'utilizzo di tessuto cerebrale dei roditori nelle analisi immunohistochemical a valle; Tuttavia, può essere applicato a diversi ambiti scientifici che utilizzano cryosectioning.

Introduzione

Qui, presentiamo il protocollo per un metodo novello, che noi chiamiamo Megabrain, sviluppato per donatrici roditore più cervelli contemporaneamente per procedure immunohistochemical a valle. Un Megabrain consente la produzione di singole diapositive che contiene il tessuto da più animali. Questa tecnica è stata ottimizzata per tagliare sezioni coronali da 9 emisferi di ratto adulto, o 5 cervello adulto completo, contemporaneamente. Pertanto, la tecnica è più applicabile in studi immunohistochemical grande o altre analisi fatto sul tessuto cerebrale montata da un grande gruppo degli animali.

Immunohistochemistry implica l'uso di anticorpi specifici diretti contro le proteine di interesse per comprendere e caratterizzare la loro espressione e cambiamenti cellulari nel tessuto specifico^1,2,3. L'uso di immunohistochemistry è prevalente in ricerca in neuroscienza, tra le altre discipline scientifiche, aiutando nella comprensione del cervello⁴cellulare e molecolare. Studi su larga scala che coinvolge molti animali e sezioni del cervello possono essere sia risorse e tempo intensivo. Come tale, c'è un poliedrico razionale dietro lo sviluppo della Megabrain: per ridurre il tempo trascorso cryosectioning, montaggio e la macchiatura del tessuto, durante l'utilizzo di conseguenza meno reattivi. Inoltre, la possibilità di semplificare il processo e macchia più cervelli nello stesso turno aiuta ad alleviare alcuni della variabilità tra lotti, una limitazione di immunohistochemistry³di colorazione. Inoltre, un Megabrain di sezionamento è un'alternativa di risparmio di tempo ai singoli cervelli congelati del roditore di sezionamento e permette per un rapido confronto del tessuto tra animali o anche i gruppi di trattamento mediante tecniche di microscopia.

Protocollo

La tecnica di Megabrain è stata ottimizzata usando il cervello intero e hemisected da maschio adulto di topi C57Bl6⁵, ratti Sprague-Dawley giovani e ratti Sprague-Dawley adulti che sono stati via con 1x tamponato fosfato salino (PBS) seguita da 4% paraformaldeide⁶. Risultati simili possono essere realizzati in altri ceppi di topo e di ratto, in entrambi i sessi e a diverse età. Lo studio per generare dati per questo manoscritto usato ratti Sprague-Dawley giovani ed è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università dell'Arizona, e animali da esperimento sono stati curati secondo la guida per la cura e l'uso del laboratorio Animali⁷.

1. crioprotezione dei cervelli perfusi

1. Seguente successo perfusione perfusione⁶, raccogliere il cervello completo^6,8 da animali e post-fissare inserendo in un flaconcino da 25 mL di paraformaldeide al 4% in PBS per 24 h.
   Attenzione: Paraformaldeide è un fissativo tessuto tossici; maneggiare con cura. Trasferire paraformaldeide in un contenitore per rifiuti in particolare etichettato che identifica la sua concentrazione e volume all'interno di una cappa chimica e poi negozio nei rifiuti chimici gabinetto fino all'eliminazione di sicurezza chimica o correttamente addestrato personale.
2. Dopo 24 h è trascorso, in una cappa aspirante, rimuovere cervelli da paraformaldeide 4% con una spatola. Trasferire il cervello in un flaconcino di circa 20 mL di soluzione di saccarosio al 15% in soluzione fisiologica tamponata 1x (TBS) fino a cervello scende sul fondo del flaconcino (circa 24 h).
3. In seguito, trasferire il cervello ad un flacone di circa 20 mL di soluzione di saccarosio al 30% in 1 x TBS, fino a quando il cervello scende sul fondo del flaconcino (circa 24-48 h).

2. cervello congelamento

1. Posizionare un bicchiere di vetro 500 mL su un letto di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio. Versare il bicchiere di vetro di 300 – 400 mL di isopentano (2 metil-butano).
2. Lasciare che la temperatura di isopentano raggiungere tra-45 ° C e -50 ° C. Strettamente monitorare e mantenere la temperatura con un termometro, mantenendola costante durante tutta la procedura. Assicurarsi che le letture sono tratte da metà della soluzione e non mentre si tocca il fondo o il lato del bicchiere.
3. Sul banco, riempire un USA e getta l'incorporamento di stampo (Vedi elenco materiali) circa 1/2 pieno di temperatura ottimale di taglio (OCT; Vedi Tabella materiali) Compound. Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria nello strumento di personalizzazione. Se ci sono eventuali bolle d'aria rimuovere con una spatola o un ago.
4. Rimuovere il primo cervello dal flaconcino di saccarosio al 30% con una spatola. A questo punto, sia congelare cervello intero o Henna, a seconda del disegno dello studio.
   1. Per i cervelli hemisected, utilizzare una nuova lama di rasoio per fare un taglio pulito attraverso il tessuto per separare gli emisferi. Se non necessari per lo studio, è possibile rimuovere i bulbi olfattivi e cervelletto in questa fase. Se il cervelletto è necessaria per lo studio, si consiglia di tagliare una zona pianeggiante nella parte posteriore del cervello per aiutare il cervello nel levarsi in piedi dritto nello stampo. Se lo studio richiede solo tessuto da una regione localizzata, una matrice di cervello del roditore può essere utilizzata per bloccare il cervello basato su coordinate note.
5. Dare cervello numerico in un sistema di denominazione. Disegnare un diagramma come mostrato in Figura 1. Scrivere il numero del cervello primo di essere messo nello stampo Megabrain in posizione 2, lasciando la posizione 1 come uno spazio vuoto per facilitare la rapida identificazione dell'orientamento in cui i cervelli sono stati congelati.
6. Utilizzando smussate pinze o pinzette, pick up il cervello per essere collocato in posizione 1. Orientare il cervello con il lato da tagliare prima verso l'alto. Abbassare il cervello in personalizzazione nella posizione appropriata, utilizzando le pinzette per regolare la sua posizione fino a quando non si leva in piedi in modo indipendente.
7. Ripetere i passaggi da 2.3 – 2.5 per i restanti cervello/emisferi congelati nelle posizioni 3 – 10. Evitare di posizionare i cervelli/emisferi in una disposizione simmetrica.
8. Scrivi una recensione su 9 tutti i cervelli nello stampo Megabrain. Una volta che i cervelli sono in piedi in modo indipendente, in posizione verticale e orientato correttamente nello strumento di personalizzazione (come mostrato nella Figura 2B), è necessario aggiungere ulteriori OCT allo stampo (fino a coprire la parte superiore del cervello). Ancora una volta, di garantire che non ci sono bolle d'aria visibili nei PTOM.
9. Utilizzare le pinze per tenere l'angolo dello stampo, assicurando che il forcipe non diventano parzialmente sommersa di personalizzazione di Office (Figura 3A). Prestando attenzione a mantenere il livello di muffa, abbassare la muffa in isopentano (-45 ° C a-50 ° C) affinché il fondo terzo di stampo è sommerso. Tenerlo qui per consentire eventuali bolle di personalizzazione di Office a salire in superficie e lontano dal tessuto (Figura 3B).
10. Dopo 30 s, inferiore dello stampo intero in isopentano e rilascio dal forcipe, lasciando il Megabrain sommerso per almeno 3 min (Figura 3). Garantire che la muffa è mantenuta il livello, quindi cervelli rimangono in posizione verticale ed equidistante (Figura 3D).
11. Dopo 3 min, utilizzare le pinze per rimuovere lo stampo contenente il congelato, OCT embedded cervelli (Figura 3E) dall'isopentano.
12. Immediatamente, avvolgere lo stampo e il relativo contenuto in un foglio di alluminio ed etichettarla con il numero di animali o identificazione Megabrain. Toccare il Megabrain congelati come con parsimonia possibile per evitare lo scongelamento il tessuto.
13. Questo Megabrain ora può essere trasferito a un congelatore a-20 ° C e conservato per un minimo di 24h.
    Nota: Protocollo può essere messo in pausa qui e il Megabrain possono essere congelati fino a quando il criosezionamento avviene.

3. preparare il Megabrain per il sezionamento del criostato

1. Impostare la temperatura della cella del criostato a-19 ° C. Assicurarsi che tale temperatura viene raggiunta prima di continuare. Durante il sezionamento, accertarsi che la temperatura della cella rimane tra-18 ° C e -20 ° C.
2. Prendere la Megabrain dal congelatore a-20 ° C e inserirlo al criostato. Inoltre, inserire un mandrino delle dimensioni di dimensioni appropriate e due pennelli punta sottili del criostato. Lasciare il Megabrain sia il mandrino del criostato per almeno 15 min a temperatura del criostato.
3. Etichettare in modo appropriato i vetrini con il numero di identificazione di Megabrain e il numero di diapositiva. Appoggiare queste diapositive su una diapositiva più calda (35 – 45 ° C).
4. Scartare il Megabrain dal foglio di alluminio. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare verticalmente gli angoli dello stampo per permettere una facile rimozione del blocco di OCT dallo stampo (Figura 4A).
5. Erogare un sottile strato (circa 3 mm di spessore) di ottobre sul mandrino.
6. Rapidamente, con minimo contatto tra le dita e l'OCT, posto il Megabrain il mandrino, con l'orientamento desiderato. Grande forcipe utilizzabile anche per questo passaggio per ridurre al minimo lo scongelamento. Prima di iniziare a sezione, lasciare il Megabrain montato chuck nel criostato per 15 – 20 minuti consentire la personalizzazione di congelare completamente.
7. Una volta che lo strato di base di ottobre ha congelato, applicare uno strato spesso di 2 mm OCT intorno ai lati del Megabrain e permettere che questo correre giù da entrambi i lati sul mandrino. Questo consente di proteggere il Megabrain al mandrino. Ancora una volta, prima di continuare, è possibile lasciare il mandrino Megabrain montato nel criostato per 15 – 20 minuti consentire la personalizzazione di Office congelare.
8. Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere qualsiasi OCT in eccesso dai lati o fondo del mandrino (Figura 4B).

4. Cryosectioning la Megabrain

1. Prima di iniziare, assicurarsi che un becher contenente almeno 20 mL di PBS 1X sia accessibile.
2. Posizionare il mandrino, montato con il Megabrain, nella testa del mandrino del criostato (Figura 4B).
3. Impostare il criostato per tagliare lo spessore desiderato. La metodologia attuale è stata ottimizzata per 10 µm a 50 µm sezioni.
4. Tagliare il OCT e tessuto quanto necessario per raggiungere la regione del cervello desiderato per la raccolta del tessuto (Figura 4).
5. Quando si è pronti a raccogliere il tessuto, abbassare la piastra stendi fino a posizionarla sul palco e ruotare la maniglia di criostato per prendere una singola sezione. Lentamente sollevare la piastra stendi-fetta, facendo attenzione che la Megabrain sezionato non è fissato alla piastra stendi-fetta e non cadere fuori dal palco, Figura 4).
6. Delicatamente e utilizzare i pennelli per srotolare la sezione Megabrain fino a quando è disteso sulla scena criostato (Figura 5A). (Se necessario, tenere il OCT piatto utilizzando i pennelli per evitare di rotolamento).
7. Togliere il vetrino dalla diapositiva più caldo e posiziona la diapositiva, con l'etichetta rivolta verso il basso, sopra la sezione Megabrain sul palco permettendo la sezione ad attaccarsi alla diapositiva.
8. Rapidamente applicare una goccia di PBS 1X per ogni sezione di tessuto sulla diapositiva e non permettere a questi di asciugare fino a quando essi hanno stati spazzolati piatti (Vedi punto 4.9).
9. Utilizzare un pennello punta bene immerso in PBS 1X spazzola fuori tutte le bolle nel tessuto e spiegare il tessuto in modo che sta disteso sulla diapositiva (figura 5B). Fare attenzione a non modificare la posizione delle sezioni del cervello e così perdere la posizione relativa alle altre sezioni del tessuto. Manipolare il tessuto con cura per evitare rotture. Mantenere sezioni del cervello lontano dai bordi della diapositiva, come è necessario per un vetrino coprioggetto e applicazione di penna PAP in alcuni protocolli di colorazione spazio periferico.
10. Porre il vetrino indietro sulla diapositiva più caldo e asciutto per 45 min. copertina come necessario per impedire alla polvere di depositarsi sul tessuto. Una volta asciutto, è possibile archiviare le diapositive in a-80 ° C fino al successivo utilizzo.

Risultati

Un risultato positivo a questa procedura è il tessuto che si trova pianamente sulla diapositiva, senza bolle o lacrime, l'orientamento in cui erano congelati. Sezioni di tessuto sono spaziate uniformemente apart e facilmente identificabili a causa di buon piazzamento del cervello nei PTOM e buona notazione come dimostrato nella Figura 1. Supponendo che il tessuto cerebrale è stato raccolto da animali di età simile, e che il tessuto è stato allineato corre...

Discussione

Durante questa procedura dovrebbe essere considerato che la temperatura della Megabrain e i suoi dintorni deve essere costantemente monitorata per evitare lo scongelamento e il ri-congelamento del tessuto. Il cervello può essere rimosso solo dal congelatore a-20 ° C fino a 3 volte come ogni volta che viene toccata e sinistra nel criostato, con una temperatura più calda fluttuante, il tessuto si scongela e si ricongela, causando una gelatina come consistenza e l'integrità di tessuto anormale¹⁰....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065