Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.

Resumo

Histologia e imunohistoquímica são métodos de rotina de análise para visualizar a anatomia microscópica e localizar as proteínas dentro de tecidos biológicos. Em neurociência, bem como uma infinidade de outros campos científicos, estas técnicas são utilizadas. Imuno-histoquímica pode ser feito em tecido de slide montado ou seções flutuantes. Preparação de amostras de slides montados é um processo intensivo. O seguinte protocolo para uma técnica, chamada de Megabrain, reduziu o tempo levado para cryosection e montagem de tecido cerebral em até 90% combinando vários cérebros em um único bloco congelado. Além disso, esta técnica reduzida variabilidade vista entre rodadas, em um grande estudo histoquímico de coloração. A técnica atual foi otimizada para o uso de tecido cerebral de roedores em análises imuno-histoquímica a jusante; no entanto, pode ser aplicado a diferentes áreas científicas que usam cryosectioning.

Introdução

Aqui, apresentamos o protocolo para um método novo, que chamamos de Megabrain, desenvolvido para cryosection vários roedores cérebros simultaneamente para procedimentos de imuno-histoquímica a jusante. Um Megabrain permite a produção de slides único contendo tecido de vários animais. Esta técnica foi otimizada para corte coronais seções de 9 hemisférios do rato adulto, ou 5 cérebros completo adultos, simultaneamente. Portanto, a técnica é mais aplicável em estudos imuno-histoquímicos grandes ou outras análises feitos no tecido cerebral slide-montado de uma grande coorte de animais.

Imuno-histoquímica envolve o uso de anticorpos específicos dirigidos contra proteínas de interesse para compreender e caracterizar a sua expressão e as mudanças celulares em tecido específico^1,2,3. O uso de imuno-histoquímica é prevalente em pesquisas da neurociência, entre outras disciplinas científicas, auxiliando na compreensão do cérebro⁴celular e molecular. Estudos em grande escala envolvendo muitos animais e seções do cérebro podem ser tanto recurso e tempo intensivo. Como tal, há uma multifacetada lógica por trás do desenvolvimento da Megabrain: reduzir o tempo gasto cryosectioning, montagem e manchando o tecido, enquanto estiver usando, consequentemente, menos reagentes. Além disso, a capacidade de agilizar o processo e manchar o cérebro múltiplas na mesma rodada ajuda a aliviar um pouco a variabilidade entre lotes, uma limitação de imuno-histoquímica³a coloração. Além disso, um Megabrain de corte é uma alternativa de economia de tempo para secionar cérebros de roedores congelados individuais e permite a comparação rápida de tecido entre animais ou até mesmo grupos de tratamento por técnicas de microscopia.

Protocolo

A técnica de Megabrain foi otimizada usando o cérebro todo e hemisected de C57Bl6 ratos adultos machos⁵, ratos Sprague-Dawley jovens e adultos ratos Sprague Dawley que foram perfundido com solução salina tamponada fosfato (PBS) seguida de 1x de transcardially por de paraformaldeído 4%⁶. Resultados semelhantes podem ser realizados em outras cepas de camundongo e rato, em ambos os sexos e de diferentes faixas etárias. O estudo para gerar dados para este manuscrito usado juvenis ratos Sprague-Dawley e foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidados com animais institucional Universidade do Arizona, e os animais experimentais foram cuidados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de laboratório Animais⁷.

1. Cryoprotection de cérebros perfundidos

1. Seguir bem sucedido transcardial perfusão⁶, recolher o cérebro cheio de^6,8 de animais e fixar, colocando em um frasco de 25 mL de paraformaldeído 4% em PBS por 24 h.
   Cuidado: Paraformaldehyde é um fixador de tecidos tóxicos; Manuseie com cuidado. Transferir o paraformaldeído para um contentor de resíduos especificamente rotulado que identifica sua concentração e volume dentro uma coifa química e então a loja nos resíduos químicos do armário até descartado por segurança química ou devidamente treinados.
2. Após decorrido 24 h, em uma coifa, retire os miolos paraformaldeído 4%, usando uma espátula. Transferi o cérebro para um tubo de aproximadamente 20 mL da solução de sacarose a 15% em 1x Tris salino (TBS) até o cérebro afunda até o fundo do frasco (aproximadamente 24 h).
3. Em seguida, transferi o cérebro de um frasco de cerca de 20 mL de solução de 30% de sacarose em 1 x TBS, até o cérebro afunda até o fundo do frasco (aproximadamente 24-48 h).

2. cérebro congelamento

1. Coloque um copo de vidro de 500 mL em uma cama de gelo seco em um balde de gelo. Despeje o copo de vidro, 300 – 400 mL de isopentano (2 metil-butano).
2. Permitir que a temperatura do isopentano chegar entre-45 ° C e -50 ° C. Intimamente, monitorar e manter esta faixa de temperatura com um termómetro, mantendo-se constante durante todo o procedimento. Certifique-se de que as leituras de temperatura são tomadas a partir do meio da solução e enquanto não tocar a parte inferior ou lateral do copo.
3. Sobre a bancada, preencher uma descartável incorporação molde (ver lista de materiais) cheio de aproximadamente 1/2 de temperatura de corte ideal (OCT; ver Tabela de materiais) composto. Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar na OCT. Se houver quaisquer bolhas de ar retire com uma espátula ou uma agulha.
4. Retire o primeiro cérebro do frasco de 30% de sacarose, com uma espátula. Neste ponto, ou congelar todo o cérebro ou hemisect, dependendo do projeto de estudo.
   1. Hemisected cérebro, use uma lâmina nova para fazer um corte limpo através do tecido para separar os hemisférios. Se não é necessário para o estudo, remova o cerebelo e os bulbos olfatórios nesta fase. Se o cerebelo é necessária para o estudo, sugere-se para cortar uma área plana na extremidade posterior do cérebro para auxiliar o cérebro no pé direto no molde. Se o estudo requer apenas o tecido de uma região localizada, uma matriz de cérebro de roedor pode ser usado para bloquear o cérebro com base nas coordenadas conhecidas.
5. Dar o cérebro um numérico nomeando o sistema. Desenhe um diagrama como mostrado na Figura 1. Escreva o número do primeiro cérebro para ser colocado no molde Megabrain na posição 2, deixando a posição 1 como um espaço em branco para ajudar na identificação rápida da orientação em que o cérebro foram congelado.
6. Usando fórceps rombudo ou uma pinça, pegar o cérebro para ser colocado na posição 1. Oriente o cérebro com o lado a ser cortado primeiro virado para cima. Baixe o cérebro em OCT no local apropriado, usando a pinça para ajustar sua posição até que ela representa de forma independente.
7. Repita as etapas de 2.3-2.5 para os cérebro/hemisférios restantes a serem congelados em posições 3 – 10. Evite os miolos/hemisférios de posicionamento em um layout simétrico.
8. Revise todos os 9 cérebros no molde Megabrain. Uma vez que o cérebro está independente, ereto e corretamente orientado na OCT (como mostrado na Fig. 2B), adicione mais OCT no molde (até o topo dos cérebros são cobertas). Novamente, certifique-se que não há nenhuma bolha de ar visível na OCT.
9. Use a pinça para segurar o canto do molde, assegurando que a pinça não tornar-se parcialmente submerso na OCT (Figura 3A). Tendo o cuidado de manter o nível do molde, baixe o molde para o isopentano (-45 ° C a-50 ° C) para que o fundo terceiro do molde está submersa. Segure aqui para permitir que quaisquer bolhas na OCT para subir à superfície e longe do tecido (Figura 3B).
10. Após 30 s, menor o molde inteiro para o isopentano e lançamento da pinça, deixando o Megabrain submersa pelo menos 3 min (Figura 3). Certifique-se de que o molde é mantido nível, assim cérebro permanecem na posição vertical e equidistantes (Figura 3D).
11. Após 3 min, uso a pinça para remover o molde contendo o congelado, OCT incorporado cérebros (Figura 3E) do isopentano.
12. Imediatamente, embrulhe o molde e seu conteúdo em folha de alumínio e rotulá-la com o seu número de animais ou Megabrain. Toque o Megabrain congelado com moderação quanto possível para evitar descongelar o tecido.
13. Este Megabrain agora pode ser transferida para um freezer-20 ° C e armazenado por um período mínimo de 24 h.
    Nota: Protocolo pode ser pausado aqui e o Megabrain pode ser armazenado congelados até cryosectioning tem lugar.

3. preparar o Megabrain para secionar no criostato

1. Regule a temperatura do gabinete do criostato a-19 ° C. Certifique-se que esta temperatura é atingida antes de continuar. Em toda a corte, certifique-se de que a temperatura do gabinete permanece entre-18 ° C e -20 ° C.
2. Pegue o Megabrain do congelador-20 ° C e coloque-o no criostato. Além disso, coloca um mandril das dimensões de tamanho apropriado e dois pincéis de ponta finas em criostato. Embora tanto o Megabrain e o chuck no criostato pelo menos 15 min vir para a temperatura do criostato.
3. Adequadamente os slides de etiqueta com o número de identificação de Megabrain e o número do slide. Colocar esses slides em um slide mais quente (35 a 45 ° C).
4. Desembrulhe o Megabrain partir da folha de alumínio. Use uma lâmina de barbear para cortar verticalmente os cantos do molde para permitir a fácil remoção do bloco de out do molde (Figura 4A).
5. Dispense uma camada fina (aproximadamente 3 mm de espessura) de outubro para o chuck.
6. Rapidamente, com contato mínimo entre os dedos e a OCT, coloque o Megabrain sobre o chuck, na orientação desejada. Pinça grande também pode ser usada para esta etapa para minimizar a descongelar. Antes de começar a seção, deixe o Megabrain montado chuck no criostato por 15 – 20 min permitir a OCT congelar completamente.
7. Uma vez que a camada de base de PTU congelou, aplicar uma camada de 2 mm de espessura OCT em torno dos lados da Megabrain e permitir isto a descer dos lados para o chuck. Isso ajuda a proteger o Megabrain para o chuck. Mais uma vez, antes de continuar, deixe o chuck Megabrain montado em criostato por 15 – 20 min permitir a OCT congelar.
8. Use uma lâmina de barbear para remover qualquer excesso OCT pelo lado ou fundo do mandril (Figura 4B).

4. Cryosectioning o Megabrain

1. Antes de começar, certifique-se de que um copo contendo pelo menos 20 mL 1X PBS está acessível.
2. Posicione o chuck, montado com o Megabrain, na cabeça do chuck no criostato (Figura 4B).
3. Defina o criostato para cortar na espessura desejada. A metodologia atual foi otimizada para 10 µm a 50 µm de seções.
4. Aparar a OCT e tecido conforme necessário para atingir a região do cérebro desejado para coleta de tecido (Figura 4).
5. Quando estiver pronto para coletar o tecido, baixe a placa anti-roll até descansa no palco e girar o punho do criostato para tomar uma única seção. Lentamente levante a placa anti-roll, tendo o cuidado que o Megabrain seccionado não está associado a placa anti-roll e não cai fora do palco, Figura 4).
6. Delicadamente, use os pincéis para Megabrain madeixa até ele é deitado de fase criostato (Figura 5A). (Se for necessário, mantenha a OCT plana usando os pincéis para impedir o rolamento).
7. Remover do slide mais quente e focalizar o slide, o lado da etiqueta virado para baixo, sobre a seção de Megabrain no palco permitindo a seção grudar o slide.
8. Rapidamente, aplicar uma gota de 1X PBS a cada secção de tecido no slide e não permita que estas secar até que eles tenham sido escovados lisos (consulte a etapa 4.9).
9. Use um pincel com ponta fino mergulhado em 1X PBS para escovar fora quaisquer bolhas no tecido e desdobre o tecido, então ele está deitado de slide (Figura 5B). Tome cuidado para não alterar a posição das seções do cérebro e, assim, perder a posição relativa às outras seções de tecido. Manipule o tecido com cuidado para evitar as lágrimas. Manter as seções do cérebro longe das bordas do slide, como espaço periférico é necessário para uma lamela e aplicação de caneta PAP em alguns protocolos de coloração.
10. Coloque o slide para o slide mais quente e seco durante 45 min. tampa conforme necessário para impedir que a poeira fixando-se sobre o tecido. Depois de seco, armazene os slides na-80 ° C até utilização posterior.

Resultados

Um resultado final positivo para este procedimento é um tecido que se encontra no slide, sem bolhas ou lágrimas, na orientação em que estavam congelados. Seções do tecido são espaçadas separados e facilmente identificável devido a boa colocação do cérebro na OCT e boa notação como demonstrado na Figura 1. Supondo que o tecido cerebral foi coletado de animais de idade semelhante, e que o tecido foi devidamente alinhado na OCT, seções coletadas ...

Discussão

É preciso considerar durante este procedimento que a temperatura da Megabrain e seus arredores deve ser constantemente monitorada para evitar descongelar e recongelar do tecido. O cérebro só pode ser removido do congelador-20 ° C acima de 3 vezes como cada vez é tocado e esquerda no criostato, com uma temperatura mais quente flutuante, o tecido derrete e refreezes, causando uma geleia como textura e tecido anormal integridade¹⁰. Portanto, é ideal para cortar o Megabrain tudo de uma vez.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065