複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

要約

ここでは、凍結し、単一脳の処理時間を節約する代わりとして複数の動物から脳組織をセクション プロトコルを提案します。これは免疫組織化学的に染色変動を減少し、時間セクショニングとイメージングを減少します。

要約

組織および免疫組織化学は、顕微解剖学を視覚化し、生体組織内の蛋白質を集中解析のルーチンの方法です。他の科学分野の茄多と同様、神経科学、これらのテクニックを使用します。スライド マウント組織または浮遊セクションに対する免疫組織化学を行うことができます。スライド マウントのサンプルを準備して、時間集中的なプロセスです。Megabrain と呼ばれるテクニックの次のプロトコルは、単一の冷凍ブロックに複数の脳を組み合わせることで最大 90 %cryosection とマウントの脳組織へ搬送時間を短縮しました。さらに、この手法は大規模な組織化学的研究でのラウンドを染色の間見られる変動を削減しました。現在のテクニックは、下流の免疫組織化学的解析で齧歯動物の脳組織を使用するために最適化されていますただし、セクショニングを使用する別の科学的なフィールドに適用できます。

概要

ここでは、cryosection 複数齧歯動物脳同時に下流の免疫組織化学的手順を開発した Megabrain と呼ばれる手法のプロトコルを提案する.Megabrain は、複数の動物からのティッシュを含んでいる 1 つのスライドの生産が可能です。この手法は、9 の成体ラット半球または 5 の成人における脳からコロナ セクションを同時にカットする最適化されています。したがって、手法は大規模な免疫組織化学的研究や動物の大規模コホートからスライド マウントの脳組織に行う他の分析に最も適切です。

免疫組織化学には理解し、彼らの表情と特定の組織^1,2,3の細胞変化を特徴付ける興味の蛋白質に対して指示される抗体の使用が含まれます。免疫組織化学的の使用は神経科学研究では、脳の⁴の細胞・分子の理解で助ける他の科学分野の間で流行。多くの動物との脳のセクションを含む大規模な研究は、リソースと時間がかかることができます。など、多面的な根拠、Megabrain の開発がある: セクショニング、マウント、およびその結果以下の試薬を使用しながら、組織を染色を過ごした時間を短縮します。さらに、プロセスを合理化し、同じ複数の脳を染色する能力のラウンド バッチ、免疫組織化学³の制限を染色性変動のいくつかを軽減するのに役立ちます。さらに、Megabrain を区分個別冷凍げっ歯類脳を断面に時間節約代替および動物やでも、試験治療グループ間の組織の迅速な比較により顕微鏡検査の技術。

プロトコル

Megabrain 技術は、男性成人 C57Bl6 マウス⁵、若年ラット、およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 続いて x 1 と transcardially をした大人の Sprague-dawley ラットから hemisected と全体の脳を使用して最適化されています4% パラホルムアルデヒド⁶。マウスおよびラット、男女や年齢の他の系統と同様の結果を実現できます。この原稿のデータを生成する研究若年ラットを使用し、アリゾナ大学機関動物のケアと使用委員会によって承認された、実験動物のケアのためのガイドおよび実験室の使用によると介抱され動物⁷。

1. 灌流脳に対する凍害保護作用

1. 次成功 transcardial 潅流⁶は動物から完全な脳^6、8を収集し、後 24 時間 PBS で 4% のパラホルムアルデヒドの 25 mL バイアルに置くことで解決。
   注意: パラホルムアルデヒドは有毒な組織の定着剤;取り扱いに注意。その濃度と化学の発煙のフードの中のボリュームを識別する具体的にはラベルの付いた廃棄物コンテナーにパラホルムアルデヒドを転送し、化学廃棄物の化学物質安全性または正しく破棄されるまでキャビネットの店訓練を受けた技術者。
2. 発煙のフードの 24 時間が経過した後は、ヘラを使って 4% パラホルムアルデヒドから脳を削除します。脳がバイアル (約 24 時間) の底に沈むまで、1 x 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で 15% ショ糖液約 20 mL のバイアルに脳を転送します。
3. 次に、脳は、バイアル (約 24-48 h) の底に沈むまで脳を 1 x TBS で 30% ショ糖液約 20 mL のバイアルに転送します。

2. 脳の凍結

1. ドライアイスの氷のバケツのベッドの上 500 mL ガラス製ビーカーを置きます。イソペンタン (2 メチル-ブタン) の 300-400 mL をガラスのビーカーに注ぐ。
2. -45 ° C と-50 ° C の間に到達するイソペンタンの温度を許可します。密接に監視し、温度計、それをプロシージャ全体で一定に保つこの温度範囲を維持します。温度の測定値が下またはビーカーの側面に触れる中ではなく、ソリューションの中間から取られるを確認します。
3. ベンチトップ、埋め込み型使い捨てを埋める (材料リスト参照) 最適な切削温度の約 1/2 フル (10 月;材料の表を参照してください) 化合物します。OCT で気泡がないことを確認します。ある場合任意の気泡はヘラや針でそれらを削除します。
4. 30% ショ糖のバイアルから最初の脳をヘラで削除します。この時点で、いずれかの凍結脳全体または研究デザインに応じて、hemisect。
   1. Hemisected 脳の半球を分離するのに組織をきれいにカットするのに新しいかみそりの刃を使用します。研究のため必須ではない場合は、この段階で小脳および嗅球を削除します。小脳は、調査のため必要がある場合は、金型にまっすぐ立って脳を支援するために脳の後部の端に平らな面をカットすることをお勧めします。研究には、ローカライズされた領域から組織のみ必要とする場合は、既知の座標に基づく脳をブロックする齧歯動物の脳行列を使用できます。
5. 脳の命名システム数値を与えます。図 1に示すように図を描きます。位置 2、脳が凍結された方向の迅速な特定を支援するための空白文字として位置 1 を残しての Megabrain 型に配置する最初の脳の数を記述します。
6. 1 の位置に配置する脳鈍い鉗子かピンセットを使用して、ピックアップします。最初上向きカットする側の脳に合わせます。下の適切な場所で、10 月に脳、それまでその位置を調整するピンセットを使用して独立して立っています。
7. 2.3 〜 2.5 残りの脳/半球を 3-10 の位置に固定するための手順を繰り返します。左右対称レイアウトでの脳/半球の配置は避けてください。
8. Megabrain 金型のすべての 9 の脳を確認します。一度脳が独立して立っている、直立物および正しい方向 (図 2 bに示すように)、10 月のより 10 月までに追加金型 (脳の上部を覆われている)。また、OCT で目に見える気泡がないことを確認します。
9. 鉗子はないなって部分的に冠水した (図 3 a) 10 月に確保する、金型のコーナーを保持するのに鉗子を使用します。イソペンタン (-45 ° C ~-50 ° C) に金型を低い金型レベルを維持するように注意しながら、下の 3 番目が金型に水没します。ここで表面と組織 (図 3 b) から上昇し 10 月に任意の気泡をように保持します。
10. 30 後 s、低い少なくとも 3 分 (図 3) イソペンタン、鉗子、Megabrain を残してからのリリースに全体の金型が冠水しました。脳のまま直立と等距離にあるのでカビがレベルを維持ようにする (図 3 D)。
11. 3 分後、イソペンタンから脳 (図 3E) 埋め込みを使用する 10 月、冷凍を含む金型を削除する鉗子。
12. すぐに、金型とその内容をアルミホイルで包んでと動物の番号または Megabrain 識別ラベルします。冷凍 Megabrain を組織を避けるためにできるだけ控えめにタッチします。
13. この Megabrain は今-20 ° C のフリーザーに転送し、24 時間の最小値を格納できます。
    注: プロトコルがここで一時停止にすることができます、凍結セクショニングが行われるまで、Megabrain を格納できます。

3. クリオスタットの区分のため、Megabrain の準備

1. -19 ° c、クライオスタットのキャビネットの温度を設定します。続行する前にこの温度に達したかどうかを確認します。断面中、-18 ° C と-20 ° C の間にキャビネットの温度が保たれていることを確認します。
2. -20 ° C のフリーザーから、Megabrain を取るし、クリオスタットに入れます。また、クリオスタットに適切なサイズの 2 つの細い先端絵筆チャックを配置します。クリオスタットの温度に来て、少なくとも 15 分用クライオスタットで、Megabrain とチャックの両方を残します。
3. 適切にラベルは Megabrain 識別番号、スライド番号をスライドします。これらのスライドをスライド暖かい (35-45 ° C) に置きます。
4. アルミ箔から Megabrain の包みを開けます。縦型 (図 4 a) から 10 月のブロックを簡単に除去できるように金型の手抜きをするのにかみそりの刃を使用します。
5. 10 月の薄層 (約 3 mm 厚) をチャックに分配します。
6. すぐに、指と OCT の最小限の接触、望まれる方向に、チャックに、Megabrain を配置します。融解を最小限に抑える大きな鉗子をこの手順の使用もできます。Megabrain をセクション、開始する前に完全にフリーズする 10 月を許可するように 15-20 分用クライオスタットでチャックを搭載しました。
7. 10 月の基本レイヤーを凍結している、Megabrain の側面のまわり 10 月 2 mm の厚い層を適用、チャックに側面からダウンを実行するこれを許可します。これはチャックに Megabrain をセキュリティ保護に役立ちます。もう一度前に、凍結する 10 月を許可するように 15-20 分用クライオスタットのマウント Megabrain チャックを残します。
8. 側面または底面のチャック (図 4 b) から任意の余分な 10 月を削除するのにには、かみそりの刃を使用します。

4. セクショニング、Megabrain

1. 始める前に、少なくとも 20 mL の 1x PBS を含むビーカーがアクセスできることを確認します。
2. クライオスタット (図 4 b) のチャックの頭の中に、Megabrain を搭載、チャックを位置します。
3. 所望の厚さにカットするクライオスタットを設定します。現在の方法は、10 μ m 50 μ m のセクションからに最適化されています。
4. トリム OCT と組織組織コレクション (図 4) に必要な脳の領域に到達するため必要に応じて。
5. 組織を収集する準備ができたら、ステージ上に置きますアンチロール プレートを下げるし、1 つのセクションを取るのクライオスタット ハンドルを回します。ゆっくりと持ち上げます断面 Megabrain がアンチロール プレートに接続されていないとステージ図 4オフに該当しないように注意しながら、アンチロール プレート)。
6. フラット (図 5 a) クライオスタット ステージ上にあるまで、Megabrain セクションをアンロールするペイント ブラシを慎重に使ってください。(必要な場合保持する OCT フラット ローリングを防ぐためにペイント ブラシを使用して)。
7. 暖かいスライドからスライドを削除、スライド、ラベル面を下、セクションのスライドに固執をするステージに Megabrain のセクションの上をホバーします。
8. すぐに各組織切片スライドに 1 × PBS のドロップを適用し、これらを彼らはフラット起毛されているまで乾燥を許可しない (4.9 の手順を参照してください)。
9. 組織のすべての泡をブラシとそれはスライド (図 5 b) の上に平らに横たわっているので、ティッシュを展開 1 × PBS 中に浸漬微細先端絵筆を使用します。脳断面の位置を変更し、従って他のティッシュ セクションに対する相対位置を失うように注意します。涙を避けるために注意して組織を操作します。スライドの端から脳セクションそのまま coverslip といくつかのプロトコルを汚すで PAP ペン アプリケーション用周辺のスペースが必要。
10. 暖かいと 45 分カバー ティッシュに沈降からほこりを防ぐために必要に応じて乾燥、バック スライドにスライドを配置します。一度乾燥し、さらに使用するまで-80 ° c でスライドを格納します。

結果

このプロシージャに肯定的な結果は、泡や涙、凍結された向きでない、スライドにある組織です。切片は、OCT で脳と図 1に示すよう良い表記の良い配置のため離れてしやすい等間隔です。脳組織は同じような年齢の動物から採取したと、組織は OCT に合っていると仮定すると、スライドの収集のセクションは似たようなコロナの平面は、動物の?...

ディスカッション

それは、融解と再組織の凍結を防ぐために、Megabrain とその周辺の温度を常に監視する必要があります、この手順で考慮必要があります。脳のみ削除できます-20 ° C のフリーザーからに 3 回としてたびにそれに触れると暖かい変動温度、組織と、クリオスタットの左を解凍し、refreezes、テクスチャや異常組織の完全性¹⁰のようなゼリーを引き起こしています。したがって、す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065