Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.

Abstract

היסטולוגיה אימונוהיסטוכימיה שיטות שגרתיות של ניתוח כדי להמחיש אנטומיה מיקרוסקופיים, בתרגום חלבונים בתוך רקמה ביולוגית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מדעי המוח, כמו גם למגוון רחב של תחומים מדעיים אחרים, טכניקות אלו משמשים. אימונוהיסטוכימיה יכול להיעשות על שקופית רכוב רקמות או מקטעים לתרשים. הכנת דוגמאות רכוב שקופיות הוא תהליך אינטנסיבי זמן. פרוטוקול הבאים עבור טכניקה, קרא את Megabrain, מופחת לוקחים את הזמן כדי cryosection ו הר רקמת המוח על ידי 90% על-ידי שילוב המוחות מרובים לתוך בלוק קפוא יחיד. יתר על כן, טכניקה זו הקטינה השתנות ראיתי בין מכתים סיבובים, במחקר פתולוגיה גדולים. הטכניקה הנוכחי הותאם לשימוש רקמת המוח מכרסמים בניתוחים immunohistochemical במורד הזרם; עם זאת, ניתן להחיל אותה על תחומים מדעיים שונים, להשתמש cryosectioning.

Introduction

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שיטה, אשר נקרא Megabrain, פותח על מנת cryosection מכרסם מרובים המוח במקביל להליכי immunohistochemical במורד הזרם. Megabrain מאפשר הייצור של שקופיות יחיד המכיל רקמות מחיות מרובים. טכניקה זו מוטבה לחתוך קטעים הילתית ההמיספרות עכברים בוגרים 9, או 5 מבוגרים. המוח מלא, בו זמנית. לכן, הטכניקה ישימה ביותר ללימודי immunohistochemical גדולים או ניתוחים אחרים שנעשה על רקמת המוח רכוב שקופיות מתוך קבוצה גדולה של בעלי חיים.

אימונוהיסטוכימיה כרוכה בשימוש של נוגדנים ספציפיים נגד חלבונים לעניין להבין ולאפיין שלהם ביטוי ושינויים סלולר רקמות ספציפיות^1,2,3. השימוש אימונוהיסטוכימיה נפוצה במחקר מדעי המוח, בין דיסציפלינות מדעיות אחרים, מסייע בהבנה תאית ומולקולרית של המוח⁴. מחקרים רחבי היקף שכללו חיות רבות ומקטעים המוח יכול להיות אינטנסיבי בזמן והן משאבים. ככזה, יש תירוץ רבת מאחורי התפתחות Megabrain: כדי לצמצם את זמן בילה cryosectioning, הרכבה, צביעת רקמות, תוך שימוש כתוצאה מכך ריאגנטים פחות. יתר על כן, היכולת לייעל את התהליך כתם המוח מרובים באותו סיבוב מסייע להקל על חלק של השונות בין מכתים אצוות, מגבלה של אימונוהיסטוכימיה³. בנוסף, חלוקתה של Megabrain היא אלטרנטיבה חיסכון בזמן חלוקתה בודדים המוח מכרסמים קפוא ומאפשר השוואה מהירה של רקמות בין חיות או אפילו קבוצות הטיפול על ידי טכניקות במיקרוסקופ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הטכניקה Megabrain מוטבה באמצעות המוח כולו, hemisected זכר בוגר C57Bl6 עכברים⁵, חולדות ספראג-Dawley לנוער, למבוגרים חולדות ספראג-Dawley שהיו transcardially perfused עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עקב 4% paraformaldehyde⁶. ניתן להשיג תוצאות דומות של זנים אחרים של עכבר, חולדה, משני המינים, בגילאים שונים. המחקר כדי להפיק נתונים עבור כתב יד זה משמש חולדות ספראג-Dawley לנוער, אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת אריזונה ועל שימוש הוועדה, חיות ניסוי היו מטופלים לפי את המדריך עבור טיפול של ואת השימוש של מעבדה בעלי חיים⁷.

1. Cryoprotection של המוח Perfused

1. זלוף הבאים מוצלח transcardial⁶, לאסוף את המוח מלא^6,8 מחיות ותקן פוסט על-ידי הצבת לתוך בקבוקון 25 מ של paraformaldehyde 4% ב- PBS במשך 24 שעות ביממה.
   זהירות: Paraformaldehyde היא מקבע רקמות רעילים; . לטפל. העברת paraformaldehyde לתוך מיכל פסולת במיוחד שכותרתו שמזהה את ריכוז ונפח בתוך ברדס fume כימי, בחנות פסולת כימית בארון עד מסולק על ידי כימיקלים או כראוי אימן את כוח האדם.
2. לאחר 24 שעות חלף, בשכונה fume, הסר את המוח paraformaldehyde 4% בעזרת מרית. להעביר את המוח לתוך בקבוקון של 20 מ של 15% סוכרוז פתרון 1 x באגירה טריס מלוחים (TBS) עד המוח שוקע לתחתית המבחנה (כ- 24 שעות).
3. בעקבות זאת, להעביר את המוח בקבוקון של 20 מ של 30% סוכרוז פתרון 1 x TBS, עד המוח שוקע לתחתית המבחנה (כ 24-48 שעות).

2. המוח לקפוא

1. במקום גביע זכוכית 500 מ"ל על מצע קרח יבש ב דלי קרח. שופכים 300 – 400 מ של איזופנטאן (2 מתיל-בוטאן) לתוך כוס זכוכית.
2. לאפשר את הטמפרטורה של איזופנטאן להגיע בין-45 ° C ל-50 מעלות צלזיוס. מקרוב לפקח ולשמור על טווח טמפרטורות הזה עם מד חום, נשאר קבוע לאורך כל ההליך. ודא כי הטמפרטורה נלקחים מהאמצע של הפתרון, לא תוך נגיעה לתחתית או לצד של כשהספל.
3. -Benchtop, למלא חד פעמי הטבעה עובש (ראה רשימה) כ- 1/2 מלא של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (אוקטובר; ראה טבלה של חומרים) מורכבים. ודא כי ישנם אין בועות אוויר ב- OCT. אם יש בועות אוויר להסיר אותם עם מרית או מחט.
4. הסר את המוח הראשון הבקבוקון של 30% סוכרוז עם מרית. בשלב זה, או להקפיא את המוח כולו או hemisect, בהתאם לעיצוב המחקר.
   1. Hemisected מוח, להשתמש סכין גילוח חדש לעשות חתך נקי דרך רקמות כדי להפריד את ההמיספרות. אם לא נדרש לצורך המחקר, הסר את המוח ואת הריח נורות בשלב זה. אם המוח הקטן נחוצה לצורך המחקר, הוא הציע לחתוך אזור שטוח בקצה האחורי של המוח, כדי לסייע המוח עומד ישר על העובש. אם המחקר דורש רק רקמה מאזור המותאמות לשפות אחרות, מטריצה מכרסמים המוח יכול לשמש כדי לחסום את המוח על סמך הציון הידועה.
5. תן את המוח כערך מספרי שמות המערכת. צייר דיאגרמה כמוצג באיור1. לכתוב את המספר של המוח הראשון שהוצב כייר Megabrain בעמדה 2, עוזב את עמדה 1 כרווח כדי לסייע בזיהוי מהיר של הכיוון שבו המוח היו קפואים.
6. בעזרת מלקחיים בוטה או פינצטה, לאסוף את המוח כדי להציב בעמדה 1. אוריינט המוח עם הצד לחתוך את הראשון כלפי מעלה. . תוריד את המוח לתוך OCT מיקום המתאים, באמצעות את הפינצטה כדי לכוונן את המיקום שלה עד שהוא מייצג באופן עצמאי.
7. חזור על שלבים 2.3-2.5 עבור המוח/ההמיספרות הנותרים יוקפא בעמדות 3 – 10. להימנע מיקום המוח/ההמיספרות בפריסה אוסטרית.
8. סקור כל המוח 9 ב כייר Megabrain. ברגע השכל עומדים באופן עצמאי, זקוף, מכוון כהלכה ב- OCT (כפי שמוצג באיור 2B), להוסיף עוד OCT העובש (עד מכוסים העליון של המוח). . שוב, להבטיח כי אין בועות אוויר גלוי ב- OCT.
9. השתמש המלקחיים להחזיק את הפינה של העובש, הבטחת שהמלקחיים לא להיות חלקית שקוע ב- OCT (איור 3 א). נזהר לשמור על רמת עובש, להוריד את התבנית לתוך איזופנטאן (-45 ° C ל-50 ° C) כך התחתון השלישי של העובש שקוע. . תעצרו כאן כדי לאפשר בועות ב- OCT כדי לעלות אל פני השטח מן הרקמה (איור 3B)
10. לאחר 30 s, התחתון התבנית כולה לתוך איזופנטאן ואת שחרור המלקחיים, עוזב את Megabrain מתחת למים למשך לפחות 3 דקות (איור 3C). להבטיח שעובש נשמרת רמה, אז המוח תישאר זקוף, קו מקביל (דמות תלת-ממד).
11. אחרי 3 דק ', שימוש המלקחיים כדי להסיר את התבנית המכילה את הקפוא, OCT מוטבע המוח (איור 3E) מ איזופנטאן.
12. . מיד, לעטוף את התבנית והתוכן שלה בנייר אלומיניום עם מדבקה עם מספרים בעלי חיים או זיהוי Megabrain. מגע של Megabrain קפוא בצמצום ככל האפשר כדי להימנע מפשיר את הרקמה.
13. Megabrain זה יכול להיות עכשיו הועבר מקפיא-20 ° C, מאוחסנים למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
    הערה: פרוטוקול אפשר לעצור כאן, Megabrain ניתן לאחסן קפוא עד cryosectioning מתקיים.

3. הכנת Megabrain את חלוקתה על Cryostat

1. הגדר את הטמפרטורה הקבינט של cryostat-19 מעלות צלזיוס. ודא שאת החום הגיע לפני שתמשיך. ברחבי חלוקתה, להבטיח כי הטמפרטורה ארון נשאר בין-18 ° C ו-20 ° C.
2. . קח את Megabrain מהמקפיא-20 ° C ולמקם אותו לתוך cryostat. כמו כן, למקם של צ'אק של הממדים בגודל המתאים, ואת שני מכחולים משופעת דק cryostat. השאירו cryostat למשך 15 דקות לפחות לבוא עד הטמפרטורה של cryostat גם את Megabrain וגם את הצ'אק.
3. בהתאם תווית שקופיות עם מספר מזהה של Megabrain, מספר השקופית. שכב שקופיות אלה על שקופית חמים (35 – 45 ° C).
4. לפתוח את Megabrain של האלומיניום. השימוש סכין גילוח לחתוך פינות התבנית כדי לאפשר הסרה קלה של גוש של OCT מתוך העובש (איור 4A) אנכית.
5. לוותר על שכבה דקה (בערך בעובי 3 מ מ) של OCT על גבי הצ'אק.
6. מהר, עם קשר מינימלי בין האצבעות OCT, מניחים את Megabrain על הצ'אק, בכיוון הרצוי. מלקחיים גדול יכול לשמש גם עבור שלב זה כדי למזער את מפשיר. לפני הפעלת סעיף, לעזוב את Megabrain רכוב צ'אק ב cryostat למשך 15-20 דקות לאפשר ב- OCT כדי להקפיא לחלוטין.
7. כאשר שכבת הבסיס של OCT קפוא, למרוח שכבה בעובי 2 מ מ OCT בצדדים של Megabrain ולאפשר זה לדרוס הצדדים על גבי הצ'אק. פעולה זו מסייעת להבטיח את Megabrain לצ'אק... שוב, לפני שתמשיך, להשאיר את צ'אק Megabrain רכוב ב cryostat למשך 15-20 דקות לאפשר ב- OCT כדי להקפיא.
8. השתמש סכין גילוח כדי להסיר OCT עודף מכל הצדדים או בתחתית הצ'אק (איור 4B).

4. Cryosectioning Megabrain

1. לפני שתתחיל, ודא גביע המכיל לפחות 20 מ ל 1 x PBS נגישה.
2. מקם את הצ'אק, רכוב עם Megabrain, אל ראשו של צ'אק-cryostat (איור 4B).
3. הגדר את cryostat לחתוך על העובי הרצוי. המתודולוגיה הנוכחי כבר מותאם ל- 10 מיקרומטר 50 מיקרומטר למקטעים.
4. לקצץ OCT ורקמות לפי הצורך כדי להגיע אל האזור במוח הרצוי עבור אוסף רקמה (איור 4C).
5. כאשר אתה מוכן לאסוף את רקמות, הורידו את הצלחת גליל נגד עד שתוצב על הבמה ולהפוך את ידית cryostat לקחת קטע בודד. הרם לאט מהצלחת אנטי-רול, להיות זהיר כי Megabrain משרטוטי לא מחובר לצלחת אנטי-רול, לא ליפול על הבמה דמות 4D).
6. השתמש בעדינות את מכחולים כדי לבטל את הסיכום המקטע Megabrain עד הוא שוכב שטוח על הבמה cryostat (איור 5A). (אם יש צורך, להחזיק את ה-OCT שטוח באמצעות מכחולים כדי למנוע גלגול).
7. הסר שקופיות משקופית החמים ותציב את השקופית, לצד תווית למטה, מעל המקטע Megabrain על הבמה ומאפשר את המקטע לדבוק השקופית.
8. להחיל טיפה של PBS 1 x על כל סעיף הרקמה בשקופית ובמהירות אל תאפשר אלה להתייבש. עד שהם יש כבר מוברש שטוח (ראה שלב 4.9).
9. השתמש בסדר משופעת במכחול טבול 1 x PBS לצחצח את בועות בתוך הרקמה, נפרשים הרקמה אז הוא שוכב שטוח על השקופית (איור 5B). לטפל לא כדי לשנות את המיקום של הסעיפים המוח, ובכך לאבד את המיקום היחסי על המקטעים רקמות אחרות. לתפעל את הרקמות בזהירות כדי להימנע דמעות. לשמור חלקים במוח הרחק לקצוות השקופית, כמו שטח היקפי נדרש עבור coverslip ו- PAP היישום עט בפרוטוקולים מסוימים מוכתמים.
10. מקם את השקופית חזרה אל השקופית חם ויבש במשך 45 דקות הכיסוי לפי הצורך כדי למנוע אבק ליישב על הרקמה. לאחר יבש, אחסן את השקופיות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תוצאה חיובית סיום הליך זה הוא רקמה שנמצאת על השקופית, ללא בועות או דמעות, הכיוון שבו הם קפאו. מקטעי רקמת רווח אחיד בנפרד, קל לזיהוי בשל מיקום טוב של המוח ב- OCT ואת בסימון טוב כפי שהוכח באיור1. בהנחה רקמת המוח נאסף מבעלי חיים בגיל דומה, וכי הרקמה היה מיושר כראוי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זה יש לקחת בחשבון במהלך הליך זה כי הטמפרטורה של Megabrain וסביבתו חייב להיות פיקוח מתמיד כדי למנוע מפשיר, הקפאה מחדש של הרקמה. המוח ניתן להסיר מהמקפיא-20 ° C עד כדי 3 פעמים כמו בכל פעם. אל תיגע, ב cryostat, עם תנודות טמפרטורה חמה יותר, הרקמה מפשירה על ימין ועל שמאל refreezes, גורם ריבה כמו מרקם של רקמה נורמלית...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065