Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de congelación y sección de tejido cerebral de varios animales como una alternativa de ahorro de tiempo a procesar solo cerebros. Esto reduce la variabilidad de coloración durante la inmunohistoquímica y reduce la proyección de imagen y tiempo cryosectioning.

Resumen

Histología e inmunohistoquímica son métodos de rutina de análisis para visualizar la anatomía microscópica y localizar proteínas en tejido biológico. En neurociencia, así como una plétora de otros campos científicos, se utilizan estas técnicas. Inmunohistoquímica puede hacerse en tejido deslizante montado o secciones flotan libremente. Preparación de muestras de diapositivas es un proceso intensivo de tiempo. El siguiente protocolo para una técnica, llamada el Megabrain, reduce el tiempo necesario para montaje y criosección tejido cerebral hasta un 90% mediante la combinación de varios cerebros en un solo bloque congelado. Además, esta técnica reduce la variabilidad entre rondas, en un gran estudio histoquímico de la coloración. La técnica actual se ha optimizado para el uso de tejido cerebral de roedor en el análisis de immunohistochemical aguas abajo; sin embargo, puede aplicarse a distintos campos científicos que utilizan cryosectioning.

Introducción

Aquí, presentamos el protocolo para un nuevo método, que llamamos Megabrain, convertido a criosección roedor múltiples cerebros al mismo tiempo para los procedimientos de inmunohistoquímica aguas abajo. Un Megabrain permite la producción de diapositivas individuales que contienen tejido de múltiples animales. Esta técnica ha sido optimizada para cortar secciones coronales de hemisferios de rata adulta 9 o 5 cerebros completos adulto, al mismo tiempo. Por lo tanto, la técnica es más aplicable en los estudios de immunohistochemical grandes o en otros análisis realizados en tejido de cerebro montada diapositiva de una cohorte grande de animales.

Immunohistochemistry implica el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas de interés para entender y caracterizar su expresión y cambios celulares en el tejido específico^1,2,3. El uso de la inmunohistoquímica es frecuente en la investigación de la neurociencia, entre otras disciplinas científicas, ayudando en la comprensión celular y molecular del cerebro⁴. Estudios a gran escala con muchos animales y secciones del cerebro pueden ser intensivo de tiempo y recursos. Como tal, existe una razón multifacético detrás del desarrollo de lo Megabrain: reducir el tiempo dedicado cryosectioning, montaje y tinción de tejidos, mientras que, en consecuencia, menos reactivos. Además, la capacidad de agilizar el proceso y varios cerebros en el mismo la mancha redonda ayuda a aliviar parte de la variabilidad entre lotes, una limitación de inmunohistoquímica³la coloración. Además, seccionar un Megabrain es una alternativa de ahorro de tiempo al seccionamiento cerebros de roedores congelados individuales y permite la comparación rápida de tejido entre animales o incluso grupos de tratamiento por técnicas de microscopía.

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Protocolo

Se ha optimizado la técnica Megabrain con todo y hemiseccionada cerebros de varones adultos de ratones C57Bl6⁵, ratas Sprague-Dawley juvenil y ratas Sprague-Dawley adultas que fueron perfundido con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) seguido de transcardially de paraformaldehído al 4%⁶. Resultados similares se pueden lograr en otras cepas de ratón y rata, en ambos sexos y diferentes edades. El estudio para generar datos para este manuscrito utilizado ratas Sprague-Dawley juvenil y fue aprobado por el Comité de uso y cuidado Animal institucional de la Universidad de Arizona, y animales de experimentación fueron atendidos según la guía para el cuidado y uso de laboratorio Los animales⁷.

1. crioprotección de cerebros perfundidos

1. Siguiente éxito transcardial perfusión⁶, recoger el cerebro completo^6,8 de los animales y después arreglar colocando en un frasco de 25 mL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 24 h.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es un fijador de tejido tóxico; Manéjela con cuidado. Transferencia de paraformaldehido en un contenedor de residuos específicamente etiquetado que identifica su concentración y el volumen dentro de una campana de humos químicos y luego almacenar en el gabinete hasta eliminados por seguridad química o bien de residuos químicos con personal capacitado.
2. Transcurrido 24 h, en una campana de humos, quitar cerebros de paraformaldehído al 4% con una espátula. Transferir el cerebro en un frasco de aproximadamente 20 mL de solución de sacarosa al 15% en solución salina tamponada con Tris de 1 x (TBS), hasta que cerebro se hunde hasta el fondo de la cubeta (aproximadamente 24 h).
3. A continuación, transferir el cerebro a un frasco de aproximadamente 20 mL de solución de sacarosa al 30% en 1 x TBS, hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo de la cubeta (aproximadamente 24-48 h).

2. cerebro congelación

1. Coloque un vaso de precipitados de vidrio de 500 mL en una cama de hielo seco en un cubo de hielo. Verter 300-400 mL de isopentano (2 metil-butano) en el vaso de vidrio.
2. Permitir que la temperatura de isopentano para llegar a entre-45 ° C y -50 ° C. Vigilar de cerca y mantener este rango de temperatura con un termómetro, manteniéndola constante durante todo el procedimiento. Asegúrese de que las lecturas de temperatura se toman desde el centro de la solución y no tocar la parte inferior o lateral del vaso.
3. En el Banco, llenar una desechable incrustar molde (véase la lista de materiales) aproximadamente 1/2 lleno de temperatura óptima de corte (OCT; véase Tabla de materiales) compuesto. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire en los PTU. Si hay burbujas de aire Retire con una espátula o con aguja.
4. Retire el primer cerebro del frasco de sacarosa al 30% con una espátula. En este punto, o bien congelar cerebros total o hemisect, dependiendo del diseño del estudio.
   1. Para hemiseccionada cerebros, utilice una cuchilla nueva para hacer un corte limpio a través del tejido para separar los hemisferios. Si no es necesario para el estudio, quite el cerebelo y bulbos olfativos en esta etapa. Si el cerebelo es necesaria para el estudio, se sugiere cortar un área plana en la parte posterior del cerebro para ayudar al cerebro en pie directamente en el molde. Si el estudio requiere sólo de una región localizada del tejido, puede utilizarse una matriz de cerebro de roedor para bloquear el cerebro basado en coordenadas conocidas.
5. Dar cerebros un numérico sistema. Dibujar un diagrama como se muestra en la figura 1. Escriba el número del primer cerebro para colocar en el molde de Megabrain en la posición 2, dejando la posición 1 como un espacio en blanco para facilitar la rápida identificación de la orientación en la que los cerebros fueron congelados.
6. Usando fórceps romos o pinzas, recoger el cerebro para colocarse en la posición 1. Oriente el cerebro con la parte a cortar primero hacia arriba. Baje el cerebro en el OCT en la ubicación adecuada, utilizando las pinzas para ajustar su posición hasta que se encuentra de forma independiente.
7. Repita los pasos 2.3 – 2.5 para los cerebros/hemisferios quedan congelados en las posiciones 3 – 10. Evite colocar cerebros/hemisferios en un diseño simétrico.
8. Revisar todos los 9 cerebros en el molde de Megabrain. Una vez que los cerebros están de pie, vertical y correctamente orientado en el OCT (como se muestra en la figura 2B), añadir más OCT al molde (hasta que se cubran la parte superior de los cerebros). Una vez más, asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire visible en los PTU.
9. Use las pinzas para sostener la esquina del molde, asegurando que el fórceps no se sumerja parcialmente en el OCT (Figura 3A). Teniendo cuidado de mantener el nivel de molde, coloque el molde en isopentano (-45 ° C a-50 ° C) para que la parte inferior tercera del molde se sumerge. Mantenerla aquí para permitir que las burbujas de los PTU a la superficie y lejos de los tejidos (figura 3B).
10. Después de 30 s, menor el molde entero en el isopentano y el lanzamiento de las pinzas, dejando el Megabrain sumergido durante al menos 3 minutos (figura 3). Asegurar ese molde se mantiene a nivel, para cerebros permanecen verticales y equidistantes (figura 3D).
11. Después de 3 minutos, uso las pinzas para quitar el molde que contiene el congelado, OCT había incrustado cerebros (figura 3E) del isopentano.
12. Inmediatamente, envuelva el molde y su contenido en papel de aluminio y etiqueta con el número de animales o identificación de Megabrain. Toque el Megabrain congelado como con moderación posible para evitar descongelar el tejido.
13. Este Megabrain se puede transferir a un congelador de-20 ° C y almacenado por un mínimo de 24 h.
    Nota: Protocolo puede hacer una pausa aquí y el Megabrain puede almacenarse congelados hasta que cryosectioning.

3. preparar el Megabrain para secciones en criostato

1. Ajustar la temperatura de criostato a-19 ° C. Asegúrese de que se alcanza esta temperatura antes de continuar. A lo largo de secciones, asegurar que la temperatura se mantiene entre-18 ° C y -20 ° C.
2. Tomar el Megabrain del congelador de-20 ° C y colocar en el criostato. También, colocar un plato de las dimensiones de tamaño adecuado y dos pinceles de punta finas en el criostato. Deje el Megabrain y el mandril en el criostato para por lo menos 15 minutos llegar a la temperatura del criostato.
3. Adecuadamente diapositivas de etiqueta con el número de identificación de Megabrain y el número de diapositiva. Coloque estas diapositivas sobre una diapositiva más caliente (35-45 ° C).
4. Desenvuelva el Megabrain del papel de aluminio. Utilice una cuchilla para cortar verticalmente las esquinas del molde para permitir la fácil remoción del bloque de OCT del molde (Figura 4A).
5. Distribuir una capa delgada (aproximadamente 3 mm de espesor) de OCT en el portabrocas.
6. Rápidamente, con mínimo contacto entre los dedos y el OCT, coloque el Megabrain en la tirada, en la orientación deseada. Pinzas grandes pueden utilizarse también para este paso para minimizar la descongelación. Antes de empezar sección, dejar el Megabrain montado tirada en el criostato para 15 – 20 minutos permitir que la OCT se congele completamente.
7. Una vez que se ha congelado la capa base de PTU, aplique una capa gruesa de 2 mm OCT alrededor de los lados de lo Megabrain y que corra por los lados en el portabrocas. Esto ayuda a asegurar el Megabrain para el mandril. Otra vez, antes de continuar, deje el mandril Megabrain montado en el criostato para 15 – 20 minutos permitir que la OCT se congele.
8. Utilice una cuchilla de afeitar para quitar cualquier exceso OCT desde los lados o la parte inferior de la tirada (Figura 4B).

4. Cryosectioning el Megabrain

1. Antes de comenzar, asegúrese de que un vaso de precipitados que contiene al menos 20 mL 1 x PBS es accesible.
2. Coloque el portabrocas, montado con el Megabrain, en la cabeza del mandril en el criostato (Figura 4B).
3. Establecer el criostato para cortar en el espesor deseado. La metodología actual se ha optimizado para 10 μm a 50 μm secciones.
4. Recortar el OCT y el tejido como sea necesario para llegar a la región del cerebro deseada para la recogida de tejido (figura 4).
5. Cuando esté listo para recoger el tejido, baje la placa estabilizadora hasta que quede en el escenario y girar el mango de criostato para tomar una sola sección. Lentamente Levante la placa estabilizadora, teniendo cuidado que el Megabrain seccionado no está conectada a la placa estabilizadora y no se caiga la etapa figura 4).
6. Suavemente utiliza los pinceles para desenrollar la sección Megabrain hasta que está mintiendo en la etapa de criostato (figura 5A). (Si es necesario, mantenga el OCT plana usando los pinceles para evitar balanceo).
7. Quitar la corredera de diapositiva más caliente y pase la diapositiva, la cara de etiqueta hacia abajo, sobre la sección de Megabrain en la etapa que permite la sección se adhiera al portaobjetos.
8. Aplique una gota de 1 x PBS a cada sección de tejido en la diapositiva rápidamente y no permita que estos se sequen hasta que han cepillado planos (ver paso 4.9).
9. Utilizar un pincel de punta fino en PBS 1 x a Cepille cualquier burbuja en el tejido y desdoblar el tejido por lo que está mintiendo completamente en la diapositiva (figura 5B). Tenga cuidado de no cambiar la posición de las secciones de la cerebral y perder así la posición relativa de las otras secciones de tejido. Manipular el tejido con cuidado para evitar desgarros. Mantener las secciones de la cerebral fuera de los bordes de la diapositiva, como espacio periférico se requiere para una aplicación de lápiz PAP en algunos protocolos de tinción y cubreobjetos.
10. Colocar el portaobjetos sobre la diapositiva más cálido y seco durante 45 minutos cubierta según sea necesario para evitar que el polvo de colocar en el tejido. Una vez secas, guardar las diapositivas en a-80 ° C hasta su uso posterior.

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Resultados

Un resultado positivo para este procedimiento es tejido que se encuentra en la diapositiva, sin burbujas ni lágrimas, en la orientación en que fueron congelados. Las secciones de tejido son uniformemente aparte y fácilmente identificable debido a la buena colocación del cerebro en el OCT y la notación buena como se demuestra en la figura 1. Asumiendo que el tejido cerebral fue recogido de animales de una edad similar, y que el tejido fue alineado en los ...

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Discusión

Durante este procedimiento, debe considerar que la temperatura de lo Megabrain y sus alrededores debe ser constantemente monitoreada para evitar descongelar y volver a congelar el tejido. El cerebro puede sólo retirarse del congelador de-20 ° C hasta a 3 veces cada vez que se toca y de izquierda en el criostato, con una temperatura fluctuante más cálida, el tejido se descongela y refreezes, causando una jalea como textura y tejido anormal integridad¹⁰. Por lo tanto, es óptimo para cortar el M...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap	Fisher Scientific	03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C)	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY Razor Blade	Grainger	4A807
Edge-Rite Microtome blades	Fisher Scientific	14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes	Amazon	B079J12ZRV
PAP pen	abcam	ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially.	Electron Microscopy Sciences	EMS065