JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول تحديد الخلية اللمفاوية غشائي السكان داخل الكبد باستخدام علامات وصف. فنحن نستخدم كولاجيناز الرابع والدناز وتنميق رقيقة من الأنسجة، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، لتحديد عدد سكانها متميزة من خلايا بطانية اللمفاوية.

Abstract

داخل الكبد، والأوعية اللمفاوية توجد داخل الثالوث المدخل، ووظيفتها وصف لإزالة السائل الخلالي من الكبد إلى الغدد الليمفاوية حيث يمكن مسح الحطام الخلوية ومولدات المضادات. ونحن مهتمون للغاية في فهم كيف يمكن أن تشترك المفرج اللمفاوي في التهاب ووظيفة الخلايا المناعية داخل الكبد. إلا أن القليل جداً قد تم نشر وضع بروتوكولات الهضم لعزل خلايا بطانية اللمفاوي (LECs) من الكبد أو علامات محددة التي يمكن استخدامها لتقييم الكبد لاو على أساس كل خلية. ولذلك، نحن الأمثل وسيلة الهضم وتلطيخ الكبد بغية تقييم السكان LEC في الكبد. ونحن واثقون من أن الطريقة المبينة هنا ستكون مفيدة لتحديد وعزل لاو عن الكبد، وسيتم تعزيز فهمنا لكيفية التجاوب لاو المكروية الكبد.

Introduction

دور الأوعية اللمفاوية ولاو في الكبد ليست مفهومة جيدا. بينما توجد داخل الثالوث المدخل من الكبد1 الأوعية اللمفاوية وتوسيع أثناء المرض2، سوى القليل جداً من المفهوم فيما يتعلق بوظيفة والنمط الظاهري للموظفين المدنيين المحليين داخل الكبد. مع اكتشاف علامات موجودة أساسا في لاو3، أهمية هذه الخلايا داخل المنافذ أنسجة مختلفة في التوازن والمرض سوف تملأ فجوة كبيرة في فهمنا. لاو بدور رئيسي في الحفاظ على التسامح المحيطية في العقدة الليمفاوية وأورام المنتشر بالتفاعل مباشرة مع تي الخلايا4،،من56،،من78، 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يمكن تعزيز لاو في العقدة الليمفاوية حصانة وقائية عن طريق تفاعلها مع الخلايا الجذعية المهاجرة14،،من1516. ولذلك، هناك أدوار متعددة للأو التي قد تكون محددة للأنسجة والتفاعلات التي يتواجدون فيها. ومع ذلك، سوى القليل جداً من المفهوم حول كيفية تفاعل لاو مع الخلايا المناعية في الأنسجة أو الكيفية التي تعمل بها لاو في أنظمة الجهاز المختلفة؛ وهكذا، تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس كل خلية داخل الكبد أو الأجهزة الأخرى قد يؤدي إلى التقدم في كيفية برنامج لاو الحصانة الخاصة بالانسجة. بينما الكثير من المؤلفات التي تركز على LECs في الكبد يستخدم الفحص المجهري لتصور لاو استخدام واحد أو اثنين من علامات ومورفولوجيا17، أنجز القليل جداً على وجه التحديد تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية باستخدام التدفق الخلوي، على الرغم من أن إحدى الدراسات تقييم الاختلافات بين خلايا الكبد بطانية جيبية () ولاو18. التمكن من تحليل السكان LEC في الكبد من خلال التدفق الخلوي يسمح للدراسة المتعمقة للنمط الظاهري LEC أثناء التوازن الطبيعي أو المرض.

هناك حاجة لتقييم الموظفين المدنيين المحليين عن طريق التدفق الخلوي، عدة علامات السطحية. عادة، يتم تصور لاو بالتعبير عن ذات الصلة بروسبيرو هوميوبوكس 1 (Prox-1) أو السفينة اللمفاوية hyaluronan بطانية مستقبلات 1 (LYVE1) أو مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية 3 (VEGFR3) باستخدام الفحص المجهري. ومع ذلك، في الكبد، والتعبير عن هذه العلامات غير مقيد إلى لاو. وأعرب Prox-1 هو على نطاق واسع بخلايا الكبد خلال التنمية الكبد والتجدد، وإصابة19والتعبير عن LYVE1 و VEGFR3 ب الكبد خلايا بطانية جيبية18. في العقدة الليمفاوية، حددت لاو استخدام التدفق الخلوي كمجموعات من التمايز (CD) CD45-و CD31 + وبودوبلانين + (بدبن)16. بيد أن هذا النهج ضئيل جداً لعزل لاو في الكبد منذ CD45-CD31 + الخلايا سيتم التقاط خلايا بطانية, والسكان الغالبة للخلايا البطانية الوعائية في الكبد لسيكس. وهكذا، علامات أخرى ضرورية للتمييز بين السكان LEC نادرة من السكان لسيك وفيرة. CD16/32 (معبراً عنها بالنضج لسيكس18) و CD146 (مشترك خلايا بطانية وعائية علامة التي يغلب عليها الطابع أبداها الكبد خلايا بطانية جيبية20 مع قليل من لا تعبير اللمفاوية داخل الكبدية الكبد خلايا بطانية21) كانت علامات المرشح.

ولذلك، نحن الأمثل طريقة لعزل وتصور لاو في الكبد استخدام أعلاه علامات، CD45، CD31، CD146، CD16/32، وبدبن للتدفق الخلوي. يصف لنا استخدام كولاجيناز الرابع، 1 الدناز، وفصل الميكانيكية لهضم أنسجة الكبد في تعليق خلية واحدة. كما يصف لنا استخدام التدرج الكثافة إيوديكسانول لعزل الخلايا غير متني (المجلس الوطني) وإزالة الحطام الخلوية. وأخيراً، استخدام علامات متعددة، علينا أن نحدد استراتيجية النابضة الخلوي التدفق الأمثل لتحديد الموظفين المدنيين المحليين من الكبد مع بدبن كعلامة الغالبة.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كولورادو انشوتز حرم الجامعة الطبية.

1-إعداد المواد

  1. جعل حلاً 5 ملغ/مل من الدناز أنا في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
  2. جعل الخليط الهضم بإضافة 5,000 يو/مليلتر من كولاجيناز الرابع إلى وسائط اها في انقر فوق.
  3. حرارة خليط الهضم عند 37 درجة مئوية عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  4. جعل عزلة المخزن المؤقت عن طريق إضافة ألبومين المصل البقري 4.8 في المائة (BSA) وحمض الإيثيلين 2 مم (يدتا) إلى هانكس متوازنة الحل الملح (حبس).
  5. إجراء مخزن مؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) بإضافة كلوريد الأمونيوم 100 مم و 10 مم كهكو3مم 0.1 أدتا إلى المقطر H2o.

2-إعداد تعليق خلية واحدة من كبد الفأر

  1. Euthanize الماوس مع CO2 والتفكك عنق الرحم.
  2. رذاذ أسفل الماوس مع الإيثانول 70% الرطب في الفراء. دبوس للماوس قدم إلى هيئة تشريح.
  3. باستخدام مقص تشريح لقطع الجلد حوالي 1 سم فوق فتحه الشرج، مع الحرص على قطع فقط من خلال الجلد (حوالي 1 ملم). سحب الجلد بعيداً عن الجسم مع ملقط مسنن وإدراج المقص بين الجلد والصفاق. فتح المقص لفصل الجلد من الصفاق، وبعد ذلك، قطع الجلد من الشق في الرقبة.
  4. دبوس الجلد إلى المجلس التشريح باستخدام دبوس واحد تحت كل ذراع، وفوق كل الساق. سحب الكيس الصفاقى وقطع صعودا نحو العنق. الاستيلاء على فصوص الكبد وقص أسفل القص.
    ملاحظة: ينبغي الحرص إذا كان سيتم استخدام أي من الكبد إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة).
  5. قص حول الكبد وإزالة الكبد من الماوس ووضعه في 4 مل الإعلام اها في انقر فوق.
  6. استخدام مشرط، قطع الكبد في مم ~ 1 قطعة القطر.
  7. إضافة 500 ميليلتر من خليط الهضم و 500 ميليلتر من الدناز الأول (2 مغ/مل) للكبد.
  8. احتضان الكبد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وبعد 15 دقيقة، المزيج السائل باستخدام ماصة 5 مل.
  9. بعد 30 دقيقة من الحضانة، نقل العينة هضمها من خلال مصفاة 100 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  10. ادفع برفق القطع المتبقية من خلال عامل التصفية مع المكبس لحقنه 1 مل.
  11. يجب غسل الفلتر مع 5 مل من المخزن المؤقت للعزلة ودفع الأنسجة بلطف من خلال المصفاة مع الجزء الخلفي من المكبس من حقنه 1 مل. كرر هذه العملية حتى يتم غسلها عامل التصفية مع 25 مل من المخزن المؤقت للعزلة.
  12. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ز للحد الأدنى 5 نضح بعناية قبالة المادة طافية.
  13. ريسوسبيند بيليه مع 4 مل من ربك تحلل المخزن المؤقت. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  14. تغسل الخلايا مع 10 مل من المخزن المؤقت للعزل والطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
  15. عد الخلايا في هيموسيتوميتير تحديد عدد كامل من الكبد.
  16. ريسوسبيند الخلايا في 5 مل إيوديكسانول 20% وطبقة منهم مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  17. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 15 دقيقة دون فرامل.
  18. إزالة الطبقة بين برنامج تلفزيوني وفي إيوديكسانول ومكان لهم، من خلال مرشح 100 ميكرومتر، في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
  19. تغسل الخلايا مع 10 مل من المخزن المؤقت للعزل والطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
  20. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS).

3-تحليل سيتوميتريك للخلايا المفردة من الكبد تدفق

  1. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير والمجهر، استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق لقياس خلايا قابلة للحياة. إضافة 10 ميليلتر من الخلايا إلى 10 ميليلتر من تريبان الأزرق ووضعها مباشرة على هيموسيتوميتير وعد الخلايا الحية (الأزرق لا) تحت مجهر. ثم، حساب عدد الخلايا كل ميكروليتير.
  2. قاسمة حوالي 5 مليون من الخلايا نونبارينتشيمال المتبقية في بئر واحدة من صفيحة 96-جيدا.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 90 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% FBS.
  5. إضافة المضادة-CD45 (1: 200)، ومكافحة-CD146 (1: 200)، ومكافحة--CD31 (1: 200)، وتضعف بدبن (1: 200) في 10 ميليلتر من 10 x 2.4G2 أو مكافحة-CD16/32 (1: 200).
    ملاحظة: تم استخدام لا كتلة Fc (2.4G2) عند استخدام الأجسام المضادة-CD16/32-المسمى.
  6. لتحديد حيث يجب تعيين غيتس، الإيجابية والسلبية، وتشمل الأسفار ناقص وصمة عار (FMO) واحدة لكل لون وجسم تحكم ايستب.
  7. لتحديد الخلايا الميتة حية مقابل ، وصمة عار مع علامة سلامة (مثل الشبح الأحمر 780). احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. تغسل الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% FBS.
  9. استخدام قاسمة صغيرة من الخلايا لضبط إعدادات الليزر والتعويض على cytometer التدفق. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على جسم مضاد لكل فلوروفوري الفردية وواحدة دون أي جسم.
    ملاحظة: اعتماداً تدفق cytometer قيد الاستخدام، ينبغي إنشاء مصفوفة تعويض لإزالة التداخل الطيفي.
  10. ضع أنبوب عينة على التحقيق سيتوميتير وجمع وتسجيل كافة الأحداث.

4. تحليل البيانات

  1. ابحث في الجانب مبعثر مقابل المبعثر إلى الأمام منطقة، بوابة على الخلايا الحية "استناداً إلى حجم ومستوى وصلاحية صبغ علامة.
  2. بعد ذلك، استخدام CD45 الرائعة البنفسجي 510 و CD31 بيركب Cy5.5، بوابة على الخلايا CD45-CD31 + باستخدام عناصر التحكم ايستب و FMO لتحديد السكان الإيجابية والسلبية.
  3. وأخيراً، استخدام CD146 v450 أو فيتك CD16/32 والجيش الشعبي الكونغولي بدبن، تأخذ CD146-بدبن + أو CD16/32-بدبن + الخلايا، مرة أخرى باستخدام عناصر تحكم ايستب و FMO، لتحديد السكان الإيجابية والسلبية. من هذه الخلايا لاو.

النتائج

واستخدمت دراسات تحليل الكبد اللمفاوي أساسا إيمونوهيستوتشيميستري إلى كوانتيتاتي بالتردد وقطر الأوعية اللمفية في الكبد. ومع ذلك، لا يسمح هذا الأسلوب لتقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية أو للتعبير عن عدة علامات، السيتوكينات، المستقطبات، أو عوامل النسخ...

Discussion

عموما أهمية لاو في منأى عن التوازن والتنظيم أصبح مؤخرا الخفيفة25. الكثير من الكتابات المنشورة على اللمفاوية يركز على الجلد والعقد الليمفاوية؛ بيد أن اللمفاوي موجودة في جميع أنحاء الجسم26 وهكذا، هناك حاجة إلى فهمنا لأهميتها في مختلف الأجهزة. هنا نعرض طريقة التي يم?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يشكر بمعهد جوته والكبد برامج المناعة الفطرية للدعم النقدي لهذا المشروع. كما يمول B.A.J.T. R01 AI121209.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Clicks/EHAA mediaIrvine Scientific9195
Collagenase IVWorthington Biochemical corporationLS004188
DNase IWorthington Biochemical corporationLS002145Deoxyribonuclease 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)BD biosciences562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)Biolegend134706Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102420Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)Biolegend127410Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)Biolegend101306Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)Biolegend101324Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dyeTONBO biosceinces3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)Biolegend400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)ebioscience1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)R&D systemsFAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)abcamab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)Bio-radMCA497
BSA (fraction V)FischerBP1600-100Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serumJackson Immunoresearch017-000-121
Donkey SerumJackson Immunoresearch017-000-121
EDTAVWRE177Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium ChlorideFischerA687-500for RBC Lysis buffer
Potassium BicarbonateFischerP184-500for RBC Lysis buffer
ScalpelFeather2975#21
100 μm cell strainerFischer22363549
2.4G2in house/ATCCATCC HB-197FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta biologicalsS11550
96 well plateCorning3788
6 well plateCorning3506
50 mL conicalTrulineTR2004
15 mL conicalFalcon352196
1 mL Pipete tipUSA scientific1111-2721
200 µL pipete tipUSA scientific1110-1700
10 µL pipete tipUSA scientific1111-3700
seriological 10 mL pipetegreiner bio-one607107
seriological 5 mL pipetegreiner bio-one606107
Cell incubatorFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometerBD biosciences
Clinical CentrifugeBeckman coultermodel X-14R

References

  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved