JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.

Özet

Karaciğer içinde lenf damarları portal Triad'ın içinde bulunan ve açıklanan işlevlerine interstisyel sıvı karaciğer lenf düğümlerine nerede hücresel artıkları ve antijenleri ankete kaldırmaktır. Nasıl lenfatik damarlara inflamasyon ve bağışıklık hücre fonksiyon içinde karaciğer dahil anlamakta çok ilgileniyoruz. Ancak, çok az sindirim karaciğer veya karaciğer değerlendirmek için kullanılan belirli işaretleri lenfatik endotel hücrelerinin (LECs) yalıtım için protokollerin oluşturulması yayımlanmış LECs hücre başına temelinde. Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş sindirim ve karaciğer karaciğer LEC nüfus değerlendirmek için boyama için bir yöntem. Biz burada özetlenen yöntemi kimlik ve karaciğer LECs, izolasyon için yararlı olacak ve bizim anlayış nasıl yanıt LECs karaciğer microenvironment güçlendirecek eminiz.

Giriş

Lenf damarları ve LECs rolünü karaciğerde de anlaşılmış değildir. Olsa da lenf damarları karaciğer1 portal üçlü içinde bulunur ve hastalık2sırasında genişletin, çok az işlev ve LECs fenotip içinde karaciğer ile ilgili anlaşılmaktadır. Üzerinde öncelikle3LECs bulunur işaretleri keşfi ile bu hücrelerin farklı doku nişler homeostazı ve hastalık içinde önemini anlayışımızın önemli bir boşluğu dolduracaktır. LECs doğrudan T hücreleri4,5,6,7,8ile, etkileşerek periferik tolerans lenf nodu ve metastatik tümörler korumada önemli bir rol var 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs lenf düğümünde koruyucu bağışıklığı göçmen dendritik hücreler14,15,16ile onların etkileşim yoluyla teşvik. Bu nedenle, doku ve etkileşimleri mevcut oldukları için belirli olabilir LECs için birden çok rol vardır. Ancak, çok az doku bağışıklık hücreleri nasıl LECs etkileşim veya nasıl farklı organ sistemlerinde LECs çalışması hakkında anlaşılmaktadır; Böylece, LECs karaciğer veya diğer organlara içinde hücre başına bazında değerlendirilmesi nasıl LECs doku özgü bağışıklık programı gelişmeler yol açabilir. Karaciğerde LECs üzerinde duruluyor edebiyat çoğunu LECs bir ya da iki işaretleri ve morfoloji17kullanarak görselleştirmek için mikroskobu kullanırken, çok az özellikle LECs akış sitometresi, yine de bir çalışmada kullanılarak hücre hücre için ayrı ayrı değerlendirmek için yapılmıştır karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri (LSECs) ve LECs18arasındaki farklılıkları değerlendirmek. LEC nüfus karaciğerde akış sitometresi tarafından analiz edememek LEC fenotip derinlemesine çalışma için normal homeostazı veya hastalık sırasında sağlar.

LECs tarafından akış sitometresi değerlendirmek için birden fazla yüzey işaretleyicileri ihtiyaç vardır. Genellikle, LECs ifade prospero ile ilgili homeobox 1 (Prox-1), lenf damarı endotel hyaluronan reseptör 1 (LYVE1) veya vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör 3 (VEGFR3) mikroskopi kullanarak tarafından görüntülenmiştir. Ancak, karaciğerde, bu işaretleri ifade LECs için sınırlı değildir. Prox-1 yaygın tarafından hepatosit karaciğer geliştirme, yenilenme ve yaralanma19sırasında ifade edilir ve LYVE1 ve VEGFR3 karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri18tarafından ifade edilir. Lenf düğümünde, LECs akış sitometresi farklılaşma (CD) kümeleri kullanılarak tanımlanır CD45-, CD31 + ve podoplanin + (PDPN)16. Ancak, bu yaklaşım LECs karaciğerde CD45 - CD31 + hücreler endotel hücreleri ele geçirecek, ve vasküler endotel hücreleri karaciğer baskın nüfusu LSECs yana yalıtmak için de en az düzeydedir. Böylece, diğer işaretleri bol LSEC nüfus nadir LEC popülasyondan ayırt etmek için ihtiyaç vardır. CD16/32 (olgun LSECs18tarafından ifade edilir) ve CD146 (içinde karaciğer sinusoids karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri20 az lenfatik tarafından herhangi bir ifade ile ifade edilen ağırlıklı olan bir ortak vasküler endotel hücre işaretçisi endotel hücreleri21) aday işaretleri vardı.

Bu nedenle, biz en iyi duruma getirilmiş izole edip yukarıdaki işaretleri, CD45, CD31, CD146, CD16/32 PDPN akış sitometresi için kullanma ve karaciğerde LECs görüntülenmesi için bir yöntem. Biz collagenase IV kullanımı, DNaz 1 ve karaciğer dokusu sindirim içine bir tek hücre süspansiyon için mekanik ayırma açıklar. Biz de iodixanol yoğunluk gradient yalıtım parenkima hücre (NPC) ve hücresel enkaz ortadan kaldırmak için nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, birden çok işaretçileri kullanarak, LECs ile PDPN baskın marker olarak karaciğer tanımlamak için en uygun akış sitometresi gating strateji belirleriz.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından onaylanmıştır.

1. hazırlık malzemeleri

  1. DNaz, 5 mg/mL solüsyon yapmak ı fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
  2. Tıklayın'ın EHAA medya için 5000 U/mL collagenase IV ekleyerek bir sindirim karışımı olun.
  3. Sindirim karışımı kullanmadan 30 dk önce için 37 ° C'de ısıtın.
  4. Bir yalıtım arabellek % 4.8 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyerek getirin.
  5. 100 mM amonyum klorür, 10 mM KHCO3ve 0,1 mM EDTA H2O. distile ekleyerek bir kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tampon yapmak

2. bir tek hücre süspansiyon bir fare karaciğer üzerinden hazırlanması

  1. Fare ile CO2 ve servikal çıkığı ötenazi.
  2. Fare kürk ıslak için % 70 etanol ile aşağı sprey. Fare pin bir diseksiyon tahta metreye.
  3. Yaklaşık 1 cm yukarıda sadece deri (yaklaşık 1 mm) yoluyla kesmek dikkatli olmak anüs, deriyi kesme diseksiyon makası kullanarak. Deri vücuttan dişli forseps ile çekin ve cilt ve karın zarını arasındaki makas ekleyin. Cilt periton ayırmak ve sonra belgili tanımlık kesme cilde boyun kesim için makas açın.
  4. PIN diseksiyon kurulu her kol altında ve her bacak üstü bir PIN kullanarak cilde. Periton sac yukarı çekin ve yukarı doğru boyun kesti. Karaciğer lobları kapmak ve göğüs kemiği altında sadece kesti.
    Not: herhangi bir karaciğer immünhistokimya (IHC) için kullanılacaksa, özen gösterilmelidir.
  5. Karaciğer kesmek ve fare karaciğer çıkarın ve 4 mL tıklayın'ın EHAA medya yerleştirin.
  6. Bir neşter kullanarak, karaciğer ~ 1 mm çap parçalar kesin.
  7. 500 µL sindirim karışımı ekleyip DNaz 500 µL karaciğere ben (2 mg/mL).
  8. Karaciğer 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 15 dakika sonra 5 mL pipet kullanarak sıvı karışımı.
  9. Kuluçka 30 dk sonra sindirilir örnek 50 mL konik tüp 100 µm süzgeç aracılığıyla aktarın.
  10. Yavaşça kalan parçaları 1-mL şırınga pistonu ile filtre aracılığıyla itin.
  11. Yalıtım arabelleği 5 mL filtresiyle yıkama ve yavaşça doku bir dalgıç arkası ile süzgeç aracılığıyla 1 mL şırınga itin. Filtre yalıtım arabellek 25 mL ile yıkanmış alıncaya kadar bunu yineleyin.
  12. 5 dk. dikkatle Aspire için süpernatant 400 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi.
  13. Pelet RBC lizis arabellek 4 mL ile resuspend. Hücreleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  14. Yalıtım tampon ve 5 min için 400 x g , santrifüj 10 mL hücrelerle yıkayın.
  15. Tam karaciğer sayısını belirlemek için bir hemasitometre üzerinde hücreleri saymak.
  16. 5 mL % 20 iodixanol de hücrelerde resuspend ve onları PBS 1 mL ile katman.
  17. Hücreleri vasıl 300 x g bir fren olmadan 15 dakika santrifüj kapasitesi.
  18. PBS ve iodixanol arasında kat kaldırmak ve, 100 µm filtreden bir yeni 50 mL konik tüp içine koyun.
  19. Yalıtım tampon ve 5 min için 400 x g , santrifüj 10 mL hücrelerle yıkayın.
  20. Süpernatant atın ve PBS 500 µL % 2 fetal Sığır serum (FBS) ile hücrelerde resuspend.

3. akış sitometrik analizinde tek karaciğer hücrelerinden

  1. Bir hemasitometre ve hücrelerin ölçmek için trypan mavi dışlama kullanarak mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Trypan mavi 10 µL için hücre 10 µL ekleyin ve hemen onları bir hemasitometre üzerinde yer ve mikroskop altında canlı hücreleri (mavi değil) saymak. Sonra microliter başına hücre sayısını hesaplayın.
  2. Aliquot yaklaşık 5 milyon 96-şey plaka tek bir kuyuya kalan nonparenchymal hücrelerinin.
  3. Senaryo Özeti 400 x g 5 min için santrifüj kapasitesi.
  4. Süpernatant atmak ve PBS 90 µL % 2 ile hücrelerde resuspend FBS.
  5. Anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) ve PDPN (1: 200) 10 2.4G2 veya anti-CD16/32 (1: 200) x 10 µL içinde seyreltilmiş ekleyin.
    Not: Anti-CD16/32-etiketli antikor kullanıldığında herhangi bir Fc engelleme (2.4G2) kullanılmıştır.
  6. Pozitif ve negatif kapıları nerede ayarlanması gerekir belirlemek için bir (FMO) leke her renk ve bir izotip kontrol antikor için eksi bir floresan içerir.
  7. Canlı ve ölü hücreleri belirlemek için bir canlılık işaretleyici (örneğin, hayalet kırmızı 780) ile leke. 30 dk için 4 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  8. PBS 100 µL % 2 ile hücrelerle yıkama FBS.
  9. Küçük bir aliquot hücre lazer ve tazminat akış sitometresi ayarları için kullanın. Her bireysel fluorophore ve herhangi bir antikor olmadan tek bir antikor hücrelerle leke.
    Not: Kullanılan akış sitometresi bağlı olarak bir tazminat matris spektral örtüşme kaldırmak için kurulmalıdır.
  10. Örnek tüp sitometresi prob üzerine yerleştirin ve toplamak ve tüm olayları kaydedin.

4. veri analizi

  1. Yan-dağılım alanı vs ileri-dağılım alanı arıyorsunuz, "canlı" hücreleri üzerine boyutu ve parçalı yapı ve canlılığı marker boya alarak kapıya.
  2. Ardından, CD45 parlak mor 510 ve CD31 PerCp Cy5.5, pozitif ve negatif örneğin alınma olasılığını belirlemek için izotip kontrol eder ve FMO kullanarak CD45 - CD31 + hücre kapısı kullanarak.
  3. Son olarak, CD146 v450 veya CD16/32 FITC ve PDPN APC kullanarak, CD146 - PDPN + veya CD16/32 Al-izotip kontrol eder ve FMO, pozitif ve negatif örneğin alınma olasılığını belirlemek için kullanarak yeniden PDPN + hücreler,. Bu LECs hücrelerdir.

Sonuçlar

Karaciğer Lenfleribile analiz çalışmaları öncelikle immünhistokimya frekans ve lenf damarları karaciğer çapını quantitate için kullanmış. Ancak, bu yöntem LECs değerlendirme hücre hücre olarak veya ifade birden çok işaretçileri, sitokinler, kemokinler veya transkripsiyon faktörleri için izin vermez. Bu nedenle, biz sordu olup olmadığını karaciğer LECs karaciğer izole olabilir ve akış sitometresi kullanılarak hesaplandı. Önceki çalışma lenf nodu LECs i...

Tartışmalar

LECs genel önem bağışıklık homeostazı ve düzenleme son zamanlarda hafif25için geldi. Yayımlanmış lenfatik edebiyatının çok fazla deri ve lenf düğümlerinde odaklanmaktadır; Ancak, Lenfleribile vücut26 bulunur ve bu nedenle anlayışımız farklı organlarda önem sırasında gereklidir. İşte hücre hücre olarak aynı anda onların ifade farklı yüzey işaretleyicileri, sitokinler, kemokinler ve transkripsiyon faktörleri gibi hücre içi proteinler da...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar GI ve karaciğer doğuştan gelen bağışıklık programları bu projenin parasal destek için teşekkür etmek istiyorum. B.A.J.T. da R01 AI121209 tarafından finanse edilmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Clicks/EHAA mediaIrvine Scientific9195
Collagenase IVWorthington Biochemical corporationLS004188
DNase IWorthington Biochemical corporationLS002145Deoxyribonuclease 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)BD biosciences562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)Biolegend134706Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102420Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)Biolegend127410Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)Biolegend101306Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)Biolegend101324Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dyeTONBO biosceinces3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)Biolegend400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)ebioscience1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)R&D systemsFAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)abcamab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)Bio-radMCA497
BSA (fraction V)FischerBP1600-100Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serumJackson Immunoresearch017-000-121
Donkey SerumJackson Immunoresearch017-000-121
EDTAVWRE177Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium ChlorideFischerA687-500for RBC Lysis buffer
Potassium BicarbonateFischerP184-500for RBC Lysis buffer
ScalpelFeather2975#21
100 μm cell strainerFischer22363549
2.4G2in house/ATCCATCC HB-197FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta biologicalsS11550
96 well plateCorning3788
6 well plateCorning3506
50 mL conicalTrulineTR2004
15 mL conicalFalcon352196
1 mL Pipete tipUSA scientific1111-2721
200 µL pipete tipUSA scientific1110-1700
10 µL pipete tipUSA scientific1111-3700
seriological 10 mL pipetegreiner bio-one607107
seriological 5 mL pipetegreiner bio-one606107
Cell incubatorFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometerBD biosciences
Clinical CentrifugeBeckman coultermodel X-14R

Referanslar

  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 143karaci erlenfatik endotel h creleriak sitometresikaraci er sin soidal endotel h crelericollagenase IV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır