Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Resumo

O objetivo do presente protocolo é identificar populações de células endoteliais linfáticas dentro do fígado usando marcadores descritos. Nós utilizamos colagenase IV e DNase e um suave de picagem de tecido, combinado com citometria de fluxo, para identificar uma população distinta de células endoteliais linfáticas.

Resumo

Dentro do fígado, vasos linfáticos são encontrados dentro da Tríade portal, e sua função descrita é para remover o líquido intersticial do fígado para os nódulos linfáticos onde restos celulares e antígenos podem ser pesquisados. Estamos muito interessados em compreender como o sistema vascular linfático pode estar envolvido na inflamação e função de células imunes dentro do fígado. No entanto, muito pouco tem sido publicado estabelecer protocolos de digestão para o isolamento de células endoteliais linfáticas (LECs) do fígado ou marcadores específicos que podem ser usados para avaliar o fígado LECs em uma base por célula. Portanto, nós aperfeiçoamos um método para a digestão e manchas do fígado, a fim de avaliar a população de LEC no fígado. Estamos confiantes de que o método descrito aqui será útil para a identificação e isolamento de LECs do fígado e reforçará a nossa compreensão de como LECs respondem para o microambiente do fígado.

Introdução

O papel dos vasos linfáticos e LECs no fígado não é bem compreendido. Enquanto os vasos linfáticos são encontrados dentro da Tríade portal do fígado¹ e expandem durante a doença², muito pouco é compreendido em relação à função e fenótipo de LECs dentro do fígado. Com a descoberta de marcadores que são encontrados principalmente no LECs³, a importância destas células dentro de nichos diferentes tecidos na homeostase e na doença preencherá uma lacuna significativa na nossa compreensão. LECs têm um papel importante na manutenção da tolerância periférica no nó de linfa e em tumores metastáticos interagindo diretamente com T células^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs no nó de linfa podem promover imunidade protetora através de suas interações com células dendríticas migratórias^14,15,16. Portanto, existem várias funções para LECs, que podem ser específicas para os tecidos e as interações em que estão presentes. No entanto, muito pouco é compreendido sobre como LECs interagem com células do sistema imunológico no tecido ou como LECs funcionam em diferentes órgãos; assim, avaliar LECs em uma base por célula dentro do fígado ou outros órgãos pode levar a avanços na como LECs program a imunidade do tecido-específica. Enquanto grande parte da literatura que enfoca LECs no fígado usa microscopia Visualizar LECs usando um ou dois marcadores e morfologia¹⁷, muito pouco tem sido feito para avaliar especificamente LECs em uma base de célula por célula usando citometria de fluxo, embora um estudo avaliar as diferenças entre células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) e LECs¹⁸. Ser capaz de analisar as populações do LEC no fígado por citometria de fluxo permite o estudo aprofundado de fenótipo LEC durante homeostase normal ou doença.

Para avaliar os LECs por citometria de fluxo, são necessários vários marcadores de superfície. Normalmente, LECs são visualizados pela expressão de prospero relacionados homeobox 1 (Prox-1), receptor de ácido hialurônico endoteliais de vasos linfáticos 1 (LYVE1) ou do receptor do fator de crescimento endotelial vascular 3 (VEGFR3) usando microscopia. No entanto, no fígado, a expressão destes marcadores não está restrita a LECs. Prox-1 é amplamente expresso pelos hepatócitos durante o desenvolvimento do fígado, regeneração e lesão¹⁹e LYVE1 e VEGFR3 são expressos por células endoteliais sinusoidais fígado¹⁸. No nó de linfa, LECs são identificados usando citometria de fluxo como aglomerados de diferenciação (CD) CD45, CD31 + e podoplanin + (PDPN)¹⁶. No entanto, esta abordagem é também mínima para isolar LECs no fígado, desde células CD45 - CD31 + irão capturar as células endoteliais, e a população predominante de pilhas endothelial vasculares no fígado é LSECs. Assim, outros marcadores são necessários para distinguir a população LEC rara da população abundante de LSEC. Tanto CD16/32 (expressado por maduro LSECs¹⁸) e CD146 (um célula endotelial vascular marcador comum que é predominantemente expressado dentro os sinusoides do fígado por células endoteliais sinusoidais fígado²⁰ com pouca ou nenhuma expressão por linfático células endoteliais²¹) foram os marcadores de candidato.

Portanto, nós aperfeiçoamos um método para isolar e visualizando LECs no fígado usando o acima marcadores, CD45, CD31, CD146, CD16/32 e PDPN por citometria de fluxo. Nós descrevemos o uso de colagenase IV, 1 DNase e separação mecânica para a digestão do tecido do fígado em uma suspensão de célula única. Também descrevemos a utilização de gradiente de densidade iodixanol para o isolamento de células não-parenquimatosas (NPC) e eliminar restos celulares. Finalmente, usando vários marcadores, determinamos a estratégia associada citometria de fluxo ideal para identificar LECs do fígado com PDPN como o marcador predominante.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus.

1. preparação dos materiais

1. Fazer uma solução de 5 mg/mL de DNase I em tampão fosfato salino (PBS).
2. Fazer uma mistura de digestão adicionando 5.000 U/mL de colagenase IV para mídia EHAA do clique.
3. Aquecer a mistura de digestão a 37 ° C por 30 min antes de usar.
4. Fazer um buffer de isolamento adicionando 4,8% albumina de soro bovino (BSA) e ácido de 2mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para Hanks equilibrada solução salina (HBSS).
5. Fazer um tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) , adicionando cloreto de amônio 100 mM, 10 mM KHCO₃e 0,1 mM EDTA para destilada H₂O.

2. preparação de uma suspensão de célula única de um fígado de rato

1. Eutanásia o mouse com o CO₂ e deslocamento cervical.
2. O mouse com etanol a 70% para molhar seu pelo uma mangueirada. Pino do rato pés para um tabuleiro de dissecação.
3. Usando uma tesoura de dissecação para cortar a pele, cerca de 1 cm acima do ânus, tendo o cuidado de cortar apenas através da pele (cerca de 1 mm). Puxe a pele longe do corpo com pinça dentada e inserir a tesoura entre a pele e o peritônio. Abra a tesoura para separar a pele do peritônio e, em seguida, cortar a pele da incisão no pescoço.
4. Pino da pele para o tabuleiro de dissecação usando um pino sob cada braço e acima de cada perna. Puxe o saco peritoneal e cortar para cima em direção ao pescoço. Pegue os lóbulos do fígado e cortar logo abaixo do esterno.
   Nota: Tenha cuidado se qualquer um do fígado será usado para imuno-histoquímica (IHC).
5. Cortar em torno do fígado e remover o fígado de rato e coloque-o em 4 mL de mídia EHAA do clique.
6. Usando um bisturi, corte o fígado em ~ 1 mm diâmetro pedaços.
7. Adicionar 500 µ l da mistura de digestão e 500 µ l do DNase I (2 mg/mL) para o fígado.
8. Incubar o fígado por 30 min a 37 ° C. Depois de 15 min, misture o líquido usando uma pipeta de 5 mL.
9. Após 30 min de incubação, transferi a amostra digerida através de um filtro de 100 µm para um tubo cónico de 50 mL.
10. Empurre suavemente as peças restantes através do filtro com o êmbolo de uma seringa de 1 mL.
11. Lavar o filtro com 5 mL de tampão de isolamento e empurre suavemente o tecido através do filtro com as costas de um êmbolo de uma seringa de 1 mL. Repita isto até que o filtro é lavado com 25 mL de tampão de isolamento.
12. Centrifugar as células a 400 x g por 5 min. Aspire cuidadosamente com folga o sobrenadante.
13. Resuspenda o pellet com 4 mL de tampão de lise de RBC. Incube as celulas em temperatura ambiente por 5 min.
14. Lave as células com 10 mL de tampão de isolamento e centrifugar 400 x g por 5 min.
15. Conte as células em um hemocytometer para determinar a contagem total de fígado.
16. Ressuspender as células em 5 mL de iodixanol 20% e os de camada com 1 mL de PBS.
17. Centrifugar as células em 300 x g durante 15 min sem travão.
18. Remover a camada entre a PBS e o iodixanol e colocá-los, através de um filtro de 100 µm, em um novo tubo cónico de 50 mL.
19. Lave as células com 10 mL de tampão de isolamento e centrifugar 400 x g por 5 min.
20. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de PBS com 2% de soro fetal bovino (FBS).

3. fluxo Cytometric análise de células únicas do fígado

1. Conte as células usando um hemocytometer e microscópio, usando trypan azul exclusão para medir células viáveis. Adicionar 10 µ l de células de 10 µ l de trypan azul e imediatamente colocá-los em um hemocytometer e contar as células vivas (não azuis) sob um microscópio. Em seguida, calcule o número de células por microlitro.
2. Alíquota de aproximadamente 5 milhões das restantes células parênquimas num único poço de uma placa de 96 poços.
3. Centrifugar as células a 400 x g por 5 min.
4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 90 µ l de PBS com 2% FBS.
5. Adicione anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) e PDPN (1: 200) diluído em 10 µ l de 10 x 2.4G2 ou anti-CD16/32 (1: 200).
   Nota: Nenhum bloco de Fc (2.4G2) foi usado quando o anticorpo anti-CD16/32-etiquetado foi usado.
6. Para determinar onde gates positivos e negativos devem ser definidos, inclua uma fluorescência menos uma mancha (FMO) para cada cor e anticorpos do isotipo controle.
7. Para determinar ao vivo contra células mortas, mancha com um marcador de viabilidade (por exemplo, fantasma vermelho 780). Incube as células a 4 ° C por 30 min.
8. Lavar as células com 100 µ l de PBS com 2% FBS.
9. Use uma pequena alíquota de células para ajustar as configurações de laser e compensação sobre o citômetro de fluxo. Manche as células com um anticorpo para cada individual fluoróforo e outra sem qualquer anticorpo.
   Nota: Dependendo o citômetro de fluxo sendo usado, uma matriz de compensação deve ser estabelecido para remover a sobreposição espectral.
10. Coloque o tubo de amostra para a sonda do citômetro e coletar e registrar todos os eventos.

4. análise de dados

1. Olhando para a área de lado-scatter vs área para diante-scatter, portão em células "ao vivo" com base em corante marcador de tamanho e granulosidade e viabilidade.
2. Em seguida, usando CD45 brilhante violeta 510 e CD31 PerCp Cy5.5, portão nas células CD45 - CD31 + usando o isotipo controles e FMO para determinar populações positivas e negativas.
3. Por último, usando CD146 v450 ou CD16/32 FITC e PDPN APC, tomar o CD146 - PDPN + ou CD16/32-PDPN + células, novamente usando controles isotype e FMO, para determinar as populações positivas e negativas. Estas células são os LECs.

Resultados

Estudos analisando fígados vasos linfáticos têm usado principalmente imuno-histoquímica para dosar a frequência e o diâmetro dos vasos linfáticos, no fígado. No entanto, esse método não permite para a avaliação da LECs numa base de célula por célula ou para a expressão de vários marcadores, citocinas, quimiocinas ou fatores de transcrição. Portanto, perguntamos se fígado LECs pode ser isolados do fígado e avaliadas utilizando citometria de fluxo. Trabalhos anteriores, ...

Discussão

A importância da LECs na homeostase imune e Regulamento veio recentemente a luz²⁵. Muita literatura publicada linfática centra-se na pele e gânglios linfáticos; no entanto, vasos linfáticos são encontrados em todo o corpo²⁶ e, assim, a nossa compreensão da sua importância em diferentes órgãos é necessária. Aqui nós mostramos um método no qual LECs no fígado podem ser estudados em uma base de célula por célula para entender melhor a sua expressão simultâne...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clicks/EHAA media	Irvine Scientific	9195
Collagenase IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	Deoxyribonuclease 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)	BD biosciences	562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)	Biolegend	134706	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102420	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)	Biolegend	127410	Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)	Biolegend	101306	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)	Biolegend	101324	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye	TONBO biosceinces	3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)	Biolegened	402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)	Biolegend	400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)	ebioscience	1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)	R&D systems	FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)	abcam	ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)	Bio-rad	MCA497
BSA (fraction V)	Fischer	BP1600-100	Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride	Fischer	A687-500	for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate	Fischer	P184-500	for RBC Lysis buffer
Scalpel	Feather	2975#21
100 μm cell strainer	Fischer	22363549
2.4G2	in house/ATCC	ATCC HB-197	FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta biologicals	S11550
96 well plate	Corning	3788
6 well plate	Corning	3506
50 mL conical	Truline	TR2004
15 mL conical	Falcon	352196
1 mL Pipete tip	USA scientific	1111-2721
200 µL pipete tip	USA scientific	1110-1700
10 µL pipete tip	USA scientific	1111-3700
seriological 10 mL pipete	greiner bio-one	607107
seriological 5 mL pipete	greiner bio-one	606107
Cell incubator	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer	BD biosciences
Clinical Centrifuge	Beckman coulter		model X-14R