小鼠肝脏消化对淋巴内皮细胞的流式细胞仪分析

摘要

该方案的目标是使用所述标记识别肝脏内的淋巴管内皮细胞群。我们利用胶原酶 iv 和 dnase 和组织的温和切碎, 结合流式细胞仪, 以确定一个独特的淋巴内皮细胞的群体。

摘要

在肝脏内, 淋巴血管被发现在门静脉三位一体, 其描述的功能是去除间质液体从肝脏到淋巴结, 在那里细胞碎片和抗原可以被调查。我们非常有兴趣了解淋巴血管可能如何参与肝脏内的炎症和免疫细胞功能。然而, 很少有发现建立消化方案, 用于分离淋巴内皮细胞 (lec) 从肝脏或特定的标记, 可用于评估肝脏 lec 的基础上, 每个细胞。因此, 我们优化了肝脏消化和染色的方法, 以评估肝脏中的 lec 群体。我们相信, 这里概述的方法将有助于识别和隔离肝脏中的 lec, 并将加强我们对 lec 如何响应肝脏微环境的理解。

引言

淋巴管和 lec 在肝脏中的作用尚不清楚。虽然淋巴血管被发现在肝1的门静脉三位一体和扩大期间的疾病 2, 很少了解在肝脏内的 lec 的功能和表型。随着主要在 lecs³上发现的标记物的发现, 这些细胞在不同组织位中的重要性将在稳态和疾病中填补我们理解中的一个重大空白。lec 通过与 t 细胞^{4、5、6、7、8、9,10,11,12,13}. 淋巴结中的 lec 可通过与迁移的树突^{状细胞14、15、16}的相互作用来促进保护性免疫。因此, 有多个角色的 loec, 这可能是特定的组织和相互作用, 其中存在。然而, 对 lec 如何与组织中的免疫细胞相互作用或 lec 如何在不同器官系统中发挥作用的了解很少;因此, 在肝脏或其他器官内的每个细胞的基础上评估 lec 可能会导致 lec 如何编程组织特异性免疫的进步。虽然许多关注肝脏中 lec 的文献都使用显微镜来可视化 lec, 使用一个或两个标记和形态学 17, 但通过一项研究, 很少用流式细胞仪在细胞上专门评估细胞上的 lec评估了肝窦内皮细胞 (lsecs) 和^{lec 18}之间的差异。通过流式细胞仪分析肝脏中的 lec 群体, 可以深入研究正常稳态或疾病期间的 lec 表型。

为了通过流式细胞仪评估 lec, 需要多个表面标记。通常情况下, lec 是可视化的表达与繁荣相关的同源毒素 1 (prox-1), 淋巴管内皮透明质酸受体 1 (lyve1) 或血管生长因子受体 3 (vegfr3) 使用显微镜。然而, 在肝脏中, 这些标记的表达并不局限于 lec。prox-1 在肝脏发育、再生和损伤¹⁹过程中广泛由肝细胞表达, lyve1 和 vegfr3 由肝正弦内皮细胞¹⁸表达。在淋巴结中, 利用流式细胞术将 lec 确定为分化 (cd) cd45 (cd31 +)、cd31 + 和 podoplanin + (pdpn)¹⁶。然而, 这种方法是太小, 无法分离肝脏中的 lec, 因为 cd45-cd1+ 细胞将捕获内皮细胞, 而肝脏中的血管内皮细胞的主要群体是 lsec。因此, 需要其他标记来区分罕见的 lec 人口和丰富的 lsec 人口。ccux32 (由成熟的 lsecs¹⁸表达) 和 cd146 (一种常见的血管内皮细胞标记, 主要由肝脏窦内皮细胞²⁰在肝脏窦内表达, 几乎没有淋巴表达内皮细胞²¹) 是候选标记。

因此, 我们利用上述标记 cd45、cd31、cd146、cc到146和 pdpn 对肝脏中的 lec 进行了隔离和可视化的方法, 用于流式细胞术。我们描述了使用胶原酶 iv, dnase 1, 和机械分离肝脏组织消化成单细胞悬浮液。我们还描述了使用碘沙诺密度梯度分离非实质细胞 (npc) 和消除细胞碎片。最后, 利用多个标记, 我们确定了以 pdpn 为主要标记的最佳流式细胞术分控策略, 以肝脏中的 lec 为主要标记。

研究方案

这里描述的所有方法都已得到科罗拉多大学安舒茨医学校园动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 材料的制备

1. 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中制备 dnase i 的 5 mgml 溶液。
2. 在点击的 ehaa 培养基中加入 5, 000 u\ l 胶原酶 iv, 制作消化混合物。
3. 使用前, 将消化混合物在37°c 下加热30分钟。
4. 在汉克斯平衡盐溶液 (hbss) 中加入4.8% 的牛血清白蛋白 (bsa) 和 2 mm 乙二胺四乙酸 (edta), 建立隔离缓冲液。
5. 加入 100 mm 氯化铵、10 mm khco 3 和 0.1 mm edta 蒸馏 h2o, 制成红细胞 (rbc) 裂解缓冲液.

2. 从小鼠肝脏制备单细胞悬浮液

1. 用 co2 和颈椎脱位对小鼠进行安乐死。
2. 用70% 的乙醇把老鼠喷下来弄湿它的皮毛。将鼠标的脚与解剖板上。
3. 使用解剖剪刀将肛门上方约1厘米处的皮肤切割, 小心只穿过皮肤 (约1毫米)。用齿形钳将皮肤从身体上拉出, 并将剪刀插入皮肤和腹膜之间。打开剪刀将皮肤与腹膜分开, 然后将皮肤从切口切割到颈部。
4. 用每个手臂下和每条腿上方的一针将皮肤固定在解剖板上。向上拉腹腔囊, 向上切向颈部。抓住肝脏的裂片, 在胸骨下面切。
   注意: 如果任何肝脏将用于免疫组织化学 (ihc), 则应注意。
5. 切周围的肝脏, 并从鼠标中取出肝脏, 并将其放置在4毫升的 click 的 ehaa 介质。
6. 使用手术刀, 将肝脏切成约1毫米直径的碎片。
7. 在肝脏中加入500μl 的消化混合物和500μl 的 dnase i (2mg/ml)。
8. 在37°c 下将肝脏产肝30分钟。15分钟后, 使用5毫升移液器混合液体。
9. 孵育30分钟后, 通过100μm 过滤器将消化后的样品转移到50毫升锥形管。
10. 用1毫升注射器的柱塞轻轻推动剩余的部件通过过滤器。
11. 用5毫升的隔离缓冲液清洗过滤器, 然后用1毫升注射器的柱塞后部轻轻推动组织通过过滤器。重复此操作, 直到使用25毫升的隔离缓冲液清洗过滤器。
12. 以 400 x g离心细胞 5分钟, 小心地从上清液中吸气。
13. 用 rbc 裂解缓冲液4毫升对颗粒进行再利用。在室温下将细胞孵化5分钟。
14. 用10毫升的隔离缓冲液和离心机在 400 x g下清洗牢房5分钟。
15. 计数血细胞仪上的细胞, 以确定完整的肝脏计数。
16. 在20% 碘沙诺的5毫升中再移植细胞, 并将其分层为1毫升的 pbs。
17. 在没有刹车的情况下, 以 300 x g离心电池15分钟。
18. 取下 pbs 和碘沙诺之间的层, 通过100μm 过滤器将其放入新的 50 ml 锥形管中。
19. 用10毫升的隔离缓冲液和离心机在 400 x g下清洗牢房5分钟。
20. 用2% 的胎牛血清 (fbs) 丢弃上清液, 在500μl 的 pbs 中重新悬浮细胞。

3. 肝脏单细胞的流式细胞仪分析

1. 使用血细胞仪和显微镜对细胞进行计数, 使用色氨酸蓝色排除来测量活细胞。将10μl 的细胞加入10μl 的色氨酸蓝, 并立即将其放置在血细胞计上, 并在显微镜下计数活细胞 (不是蓝色)。然后, 计算每微升的细胞数。
2. 将剩余的非实质细胞中的大约500万个倾斜成96孔板的一口井。
3. 以 400 x g离心细胞5分钟。
4. 放弃上清液, 用2% 的 fbs 在90μl 的 pbs 中重新悬浮细胞。
5. 加入反 cd45 (1: 200)、反 cd146 (1: 200)、反 cd31 (1: 200) 和 pdpn (1: 200), 在 10x2.4 g2 的10μl 或反 cc1632 (1:200) 中稀释。
   请注意:在使用抗 cc162 标记抗体时, 不使用 fc 阻滞 (2.4 g2)。
6. 要确定应设置正门和负门的位置, 请为每种颜色添加荧光减一 (fmo) 染色, 并添加同型对照抗体。
7. 要确定活细胞和死细胞, 用活力标记染色 (例如, 幽灵红色 780)。在4°c 下将细胞培养30分钟。
8. 用2% 的 fbs 用100μl 的 pbs 清洗细胞。
9. 使用少量的细胞来调整激光和流式细胞仪上的补偿设置。用抗体对每个单独的荧光体和没有任何抗体的荧光体的细胞染色。
   请注意:根据所使用的流式细胞仪, 应建立一个补偿矩阵, 以消除光谱重叠。
10. 将样品管放在细胞仪探头上, 收集并记录所有事件。

4. 数据分析

1. 观察侧散射区与向前散射区, 根据尺寸、粒度和活力标记染料对 "活" 细胞进行门控。
2. 接下来, 使用 cd45 明亮紫罗兰510和 cd31 percp cy5.5, 门 cd45-cd11+ 细胞使用同型对照和 fmo 来确定正和负种群。
3. 最后, 使用 cd146 v450 或 cc1632 fitc 和 pdpn apc, 取 cd146-pdpn + 或 cc16pn + 细胞, 再次使用同型对照和 fmo, 以确定正和负种群。这些细胞是 loc。

结果

分析肝脏淋巴管的研究主要是使用免疫组织化学来定量肝脏中淋巴管的频率和直径。然而, 这种方法不允许评价 lec 的细胞的基础上, 细胞的基础上, 或表达多个标记, 细胞因子, 趋化因子, 或转录因子。因此, 我们询问是否可以从肝脏中分离肝脏 lec, 并使用流式细胞仪进行评估。以前的工作分离淋巴结 lec 是使用自由酶 dl (胶原酶-i------------------------<...

讨论

lec 在免疫稳态和调节中的整体重要性最近被曝光²⁵。许多发表的淋巴文献都集中在皮肤和淋巴结上;然而, 淋巴管在全身26被发现 , 因此, 我们需要了解它们在不同器官中的重要性。在这里, 我们展示了一种方法, 其中包括一种逐细胞研究肝脏中的 lec 的方法, 以更好地了解其同时表达的不同表面标记、细胞因子、趋化因子和细胞内蛋白质, 如转录因子。该方法将有?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clicks/EHAA media	Irvine Scientific	9195
Collagenase IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	Deoxyribonuclease 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)	BD biosciences	562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)	Biolegend	134706	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102420	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)	Biolegend	127410	Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)	Biolegend	101306	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)	Biolegend	101324	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye	TONBO biosceinces	3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)	Biolegened	402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)	Biolegend	400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)	ebioscience	1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)	R&D systems	FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)	abcam	ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)	Bio-rad	MCA497
BSA (fraction V)	Fischer	BP1600-100	Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride	Fischer	A687-500	for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate	Fischer	P184-500	for RBC Lysis buffer
Scalpel	Feather	2975#21
100 μm cell strainer	Fischer	22363549
2.4G2	in house/ATCC	ATCC HB-197	FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta biologicals	S11550
96 well plate	Corning	3788
6 well plate	Corning	3506
50 mL conical	Truline	TR2004
15 mL conical	Falcon	352196
1 mL Pipete tip	USA scientific	1111-2721
200 µL pipete tip	USA scientific	1110-1700
10 µL pipete tip	USA scientific	1111-3700
seriological 10 mL pipete	greiner bio-one	607107
seriological 5 mL pipete	greiner bio-one	606107
Cell incubator	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer	BD biosciences
Clinical Centrifuge	Beckman coulter		model X-14R