Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Résumé

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Résumé

Dans le foie, les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte et leur fonction décrite consiste à éliminer le liquide interstitiel du foie vers les ganglions lymphatiques où les débris cellulaires et les antigènes peuvent être interrogés. Nous sommes très désireux de comprendre comment le système vasculaire lymphatique peut-être être impliqué dans l’inflammation et la fonction des cellules immunitaires dans le foie. Cependant, très peu a été publié d’établir des protocoles de digestion pour l’isolement des cellules endothéliales lymphatiques (ESL) du foie ou des marqueurs spécifiques qui peuvent servir à évaluer le foie ESL sur une base par cellule. Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour la digestion et du foie de coloration afin d’évaluer la population de l’ESL dans le foie. Nous sommes convaincus que la méthode décrite ici vous sera utile pour l’identification et l’isolement des ESL le foie et permettra de renforcer notre compréhension de comment ESL répondent au microenvironnement du foie.

Introduction

Le rôle des vaisseaux lymphatiques et les ESL dans le foie n’est pas bien compris. Alors que les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte du foie¹ et augmentent au cours de la maladie², très peu est entendu au sujet de la fonction et du phénotype des ESL dans le foie. Avec la découverte de marqueurs que l'on trouve principalement sur ESL³, l’importance de ces cellules à l’intérieur des niches de différents tissus dans l’homéostasie et la maladie comblera une lacune importante dans notre compréhension. ESL ont un rôle majeur dans le maintien de la tolérance périphérique dans le ganglion lymphatique et dans des tumeurs métastatiques en interagissant directement avec les cellules des T^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. ESL dans le ganglion lymphatique peut favoriser l’immunité protectrice par l’intermédiaire de leurs interactions avec les cellules dendritiques migrateurs^14,15,16. Par conséquent, il y a des rôles multiples pour les ESL qui peut-être être spécifiques à des tissus et des interactions dans lesquelles ils sont présents. Toutefois, très peu est comprise sur ESL l’interaction avec les cellules immunitaires dans les tissus ou le fonctionnement des ESL dans différents organes ; ainsi, évaluer ESL sur une base par cellule dans le foie ou d’autres organes peut-être entraîner avances dans comment ESL programmer l’immunité tissulaire spécifique. Alors qu’une grande partie de la littérature qui se concentre sur l’ESL dans le foie utilise la microscopie pour visualiser les ESL à l’aide d’un ou deux marqueurs et morphologie¹⁷, très peu a été fait afin d’évaluer plus précisément ESL sur une base de la cellule par cellule à l’aide de cytométrie en flux, si une étude a fait évaluer les différences entre cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) et ESL¹⁸. Être capable d’analyser les populations ESL dans le foie par cytométrie en flux permet l’étude approfondie du phénotype LEC pendant homéostasie normale ou d’une maladie.

Evaluer ESL par cytométrie en flux, plusieurs marqueurs de surface sont nécessaires. En général, ESL sont visualisées par l’expression de prospero liés boîte homéotique 1 (Prox-1), le récepteur acide hyaluronique endothéliale de vaisseau lymphatique 1 (LYVE1) ou le récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 3 (VEGFR3) à l’aide de la microscopie. Toutefois, dans le foie, l’expression de ces marqueurs n’est pas limitée aux ESL. Prox-1 est largement exprimée par les hépatocytes pendant le développement du foie, régénération et blessures¹⁹, et LYVE1 et VEGFR3 sont exprimés par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques¹⁸. Dans le ganglion lymphatique, ESL sont identifiés comme des grappes de différenciation (CD) à l’aide de cytométrie CD45, CD31 + et podoplanin + (PDPN)¹⁶. Cependant, cette approche est trop minime pour isoler les ESL dans le foie comme cellules CD45 - CD31 + capturera les cellules endothéliales, et la population prédominante des cellules endothéliales vasculaires dans le foie est LSECs. Ainsi, les autres marqueurs sont nécessaires pour distinguer la population ESL rare de la population de LSEC abondante. CD16/32 (exprimées par mature LSECs¹⁸) et CD146 (un cellule endothéliale vasculaire marqueur commun qui est principalement exprimé dans les sinusoïdes du foie par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques²⁰ avec peu ou aucune expression de lymphatique les cellules endothéliales²¹) ont été les marqueurs candidats.

Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour isoler et visualisation des ESL dans le foie aide ci-dessus marqueurs, CD45, CD31, CD146, CD16/32 et PDPN pour la cytométrie en flux. Nous décrivons l’utilisation de collagénase IV, DNase 1 et séparation mécanique pour la digestion du tissu hépatique en une suspension de cellules individuelles. Nous décrivons également l’utilisation de gradient de densité d’iodixanol pour l’isolement de cellules non parenchymateuses (NPC) et d’éliminer les débris cellulaires. Enfin, à l’aide de plusieurs marqueurs, nous déterminons la stratégie de blocage de cytométrie en flux flux optimal pour identifier des ESL du foie avec PDPN comme marqueur prédominant.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Colorado Campus médical d’Anschutz.

1. préparation des matériaux

1. Préparer une solution de 5 mg/mL de DNase I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Faire un mélange de digestion en ajoutant 5 000 U/mL de collagénase IV aux médias EHAA de clic.
3. Réchauffer le mélange de digestion à 37 ° C pendant 30 min avant de l’utiliser.
4. Faire un tampon d’isolement en ajoutant 4,8 % d’albumine sérique bovine (BSA) et l’acide éthylènediaminetétraacétique 2 mM (EDTA) à Hanks balanced solution saline (HBSS).
5. Faire un tampon de lyse des globules rouges (RBC) en ajoutant le chlorure d’ammonium 100 mM, 10 mM KHCO₃et 0,1 mM EDTA à eau distillée H₂O.

2. Elaboration d’une Suspension de cellules individuelles d’un foie de souris

1. Euthanasier la souris avec le CO₂ et de la dislocation cervicale.
2. Vaporiser vers le bas de la souris avec l’éthanol à 70 % pour mouiller sa fourrure. Broche de la souris pieds devant un Conseil de dissection.
3. Utiliser des ciseaux de dissection pour couper la peau environ 1 cm au-dessus de l’anus, en veillant à ne couper qu’à travers la peau (environ 1 mm). Tirez la peau du corps avec une pince crantée et insérer les ciseaux entre la peau et le péritoine. Ouvrez les ciseaux pour séparer la peau du péritoine et, ensuite, couper la peau de l’incision au cou.
4. Épinglez la peau à l’Office de la dissection à l’aide d’une broche sous chaque bras et au-dessus de chaque jambe. Tirer le sac péritonéal et couper vers le haut vers le cou. Saisir les lobes du foie et coupez juste en dessous du sternum.
   Remarque : Il faut si tout du foie sera utilisé pour l’immunohistochimie (IHC).
5. Couper autour du foie et retirez le foie de la souris et le placer dans 4 mL de médias EHAA de clic.
6. À l’aide d’un scalpel, couper le foie en ~ 1 mm de diamètre.
7. Ajouter 500 µL du mélange digestion et 500 µL de la DNase I (2 mg/mL) pour le foie.
8. Incuber le foie pendant 30 min à 37 ° C. Après 15 min, mélanger le liquide à l’aide d’une pipette de 5 mL.
9. Après 30 min d’incubation, transférer l’échantillon digéré à travers un tamis de 100 µm dans un tube conique de 50 mL.
10. Poussez délicatement les pièces restantes à travers le filtre avec le piston d’une seringue de 1 mL.
11. Laver le filtre avec 5 mL de tampon d’isolement et poussez doucement le tissu à travers la passoire avec le dos d’un piston d’une seringue de 1 mL. Répétez cette procédure jusqu'à ce que le filtre est lavé avec 25 mL de tampon d’isolement.
12. Centrifuger les cellules à 400 g pour 5 min. aspirer soigneusement éteint le surnageant.
13. Resuspendre le culot avec 4 mL de tampon de lyse de RBC. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min.
14. Laver les cellules avec 10 mL de tampon d’isolement et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
15. Compter les cellules sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre complet de foie.
16. Remettre en suspension des cellules dans 5 mL d’iodixanol de 20 % et leur couche avec 1 mL de PBS.
17. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 15 min sans un frein.
18. Enlever la couche entre le CPE et l’iodixanol et placez-les, à travers un filtre de 100 µm, dans un nouveau tube conique de 50 mL.
19. Laver les cellules avec 10 mL de tampon d’isolement et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
20. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS avec 2 % sérum fœtal (SVF).

3. cytométrie de cellules du foie

1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et microscope, utilisant le bleu trypan exclusion pour mesurer les cellules viables. Ajouter 10 µL de cellules à 10 µL de bleu trypan et placez-les immédiatement sur un hémocytomètre et compter les cellules vivantes (pas bleus) sous un microscope. Ensuite, calculez le nombre de cellules par microlitre.
2. Aliquote environ 5 millions de cellules parenchymateuses restantes dans un seul puits d’une plaque de 96 puits.
3. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules 90 µL de PBS contenant 2 % FBS.
5. Ajouter anti-CD45 (1 : 200), anti-CD146 (1 : 200), anti-CD31 (1 : 200) et PDPN (1 : 200) diluée dans 10 µL de 10 x 2.4G2 ou anti-CD16/32 (1 : 200).
   Remarque : Aucun bloc de Fc (2.4G2) a été utilisé lorsqu’on utilise des anticorps anti-CD16/32-étiqueté.
6. Pour déterminer où les portes positives et négatives doivent être définies, inclure une fluorescence moins une tache (FMO) pour chaque couleur et un anticorps de contrôle isotype.
7. Pour déterminer les vivants contre les cellules mortes, détachant avec un marqueur de viabilité (p. ex., le fantôme rouge 780). Incuber les cellules à 4 ° C pendant 30 min.
8. Laver les cellules avec 100 µL de PBS contenant 2 % FBS.
9. Une petite aliquote de cellules permet d’ajuster les paramètres laser et de compensation sur le cytomètre en flux. Colorer les cellules avec un anticorps dirigé contre chaque fluorophore individuel et l’autre sans n’importe quel anticorps.
   Remarque : Selon le cytomètre en flux utilisé, une matrice de compensation devrait être établie pour éliminer le chevauchement spectrale.
10. Placer le tube d’échantillon sur la sonde cytomètre et recueillir et enregistrer tous les événements.

4. analyse des données

1. Regarder diffusion latérale aire vs attaquant-scatter, porte sur des cellules « vivantes » basé sur la taille et de granularité et de viabilité colorant marqueur.
2. Ensuite, à l’aide de CD45 brillant Violet 510 et CD31 PerCp Cy5.5, porte sur les cellules CD45 - CD31 + à l’aide de l’isotype contrôles et FMO afin de déterminer les populations positives et négatives.
3. Enfin, en utilisant CD146 v450 ou CD16/32 FITC et PDPN APC, prendre la CD146 - PDPN + ou CD16/32-PDPN + cellules, à l’aide de contrôles isotype et FMO, pour déterminer les populations positives et négatives. Ces cellules sont les ESL.

Résultats

Des études analysant les vaisseaux lymphatiques du foie ont principalement utilisé immunohistochemistry pour quantifier la fréquence et le diamètre des vaisseaux lymphatiques dans le foie. Cependant, cette méthode ne permet pas pour l’évaluation d’ESL sur une base de la cellule par cellule, ou pour l’expression de multiples marqueurs, cytokines, chimiokines ou des facteurs de transcription. Par conséquent, nous avons demandé si foie ESL pouvait être isolées du foie et éva...

Discussion

L’importance des ESL dans l’homéostasie du système immunitaire et la régulation est récemment venu à lumière²⁵. Une grande partie de la littérature publiée lymphatique se concentre sur la peau et les ganglions lymphatiques ; Cependant, vaisseaux lymphatiques sont trouvent partout dans le corps²⁶ et, par conséquent, notre compréhension de leur importance dans les différents organes est nécessaire. Nous montrons ici une méthode dans laquelle les ESL dans le ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clicks/EHAA media	Irvine Scientific	9195
Collagenase IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	Deoxyribonuclease 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)	BD biosciences	562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)	Biolegend	134706	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102420	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)	Biolegend	127410	Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)	Biolegend	101306	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)	Biolegend	101324	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye	TONBO biosceinces	3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)	Biolegened	402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)	Biolegend	400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)	ebioscience	1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)	R&D systems	FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)	abcam	ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)	Bio-rad	MCA497
BSA (fraction V)	Fischer	BP1600-100	Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride	Fischer	A687-500	for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate	Fischer	P184-500	for RBC Lysis buffer
Scalpel	Feather	2975#21
100 μm cell strainer	Fischer	22363549
2.4G2	in house/ATCC	ATCC HB-197	FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta biologicals	S11550
96 well plate	Corning	3788
6 well plate	Corning	3506
50 mL conical	Truline	TR2004
15 mL conical	Falcon	352196
1 mL Pipete tip	USA scientific	1111-2721
200 µL pipete tip	USA scientific	1110-1700
10 µL pipete tip	USA scientific	1111-3700
seriological 10 mL pipete	greiner bio-one	607107
seriological 5 mL pipete	greiner bio-one	606107
Cell incubator	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer	BD biosciences
Clinical Centrifuge	Beckman coulter		model X-14R