העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.

Abstract

בתוך הכבד, כלי הלימפה נמצאים בתוך הטראיידים פורטל, תפקידם המתואר הוא להסיר את נוזל בין-תאי הכבד אל קשרי הלימפה איפה להיות סקר פסולת הסלולר ו אנטיגנים. . אנחנו מאוד מעוניינים להבין כיצד להערכת הלימפה מעורבים דלקת ותפקוד תא החיסון בתוך הכבד. עם זאת, מעט מאוד שפורסם הקמת מערכת העיכול פרוטוקולים עבור בידודו של תאי אנדותל הלימפה (LECs) של הכבד או סמני ספציפי יכול לשמש כדי להעריך את הכבד LECs על בסיס לכל תא. לכן, אנחנו אופטימיזציה לפעולת העיכול, מכתים של הכבד על מנת להעריך את האוכלוסייה לץ בכבד. אנו בטוחים כי השיטה שמפורטות כאן יהיה שימושי עבור זיהוי ובידוד של LECs מן הכבד, תחזק את ההבנה שלנו של איך LECs להגיב microenvironment הכבד.

Introduction

התפקיד של כלי הלימפה LECs בכבד אינה מובנת היטב. בעוד כלי הלימפה נמצאים בתוך הטראיידים הפורטל של הכבד¹ ולהתרחב במהלך המחלה², מעט מאוד מובנת לגבי תפקוד ו פנוטיפ של LECs בתוך הכבד. עם גילוי סמנים הנמצאים בעיקר על LECs³, ימלא החשיבות של תאים אלה בתוך גומחות רקמות שונות בהומאוסטזיס ומחלות פער משמעותי בהבנה שלנו. LECs יש תפקיד מרכזי בשמירה על סובלנות היקפיים הצומת לימפה, גידולים גרורות באמצעות אינטראקציה ישירה עם T תאים^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs הצומת לימפה יכול לקדם חיסון הגנתי דרך האינטראקציות שלהם עם נדידת תאים דנדריטים^14,15,16. לכן, ישנם תפקידים מרובים LECs אשר עשויים להיות ספציפיים ברקמות ואינטראקציות שבו הם נמצאים. עם זאת, מעט מאוד מובנת על איך LECs אינטראקציה עם תאים חיסוניים בתוך הרקמה או איך LECs פועלים מערכות איברים שונים; לפיכך, הערכת LECs על בסיס לכל תא בתוך הכבד או איברים אחרים עשויים להוביל ההתקדמות איך LECs תוכנית חסינות רקמות ספציפיות. אף רוב הספרים המתמקד LECs בכבד מיקרוסקופ כדי להמחיש LECs שימוש אחד או שני סמנים ומורפולוגיה¹⁷, מעט מאוד נעשה להעריך באופן ספציפי LECs על בסיס תא על-ידי התא באמצעות cytometry זרימה, מחקר אחד בכל זאת להעריך את ההבדלים בין תאי אנדותל sinusoidal הכבד (LSECs) LECs¹⁸. היכולת לנתח לץ אוכלוסיות בכבד על ידי cytometry זרימה מאפשר מחקר מעמיק של פנוטיפ לץ במהלך הומאוסטזיס נורמלי או מחלה.

כדי להעריך את LECs על ידי cytometry זרימה, נדרשים מספר סמני פני השטח. בדרך כלל, LECs הם דמיינו ידי הביטוי של גנים homeobox הקשורות פרוספרו 1 (Prox-1), קולטן חומצה היאלורונית אנדותל כלי הלימפה 1 (LYVE1) או צמיחה אנדותל כלי הדם קולטן 3 (VEGFR3) באמצעות מיקרוסקופ. עם זאת, בכבד, הביטוי של סמנים אלה אינה מוגבלת LECs. Prox-1 מבוטא באופן נרחב על-ידי hepatocytes במהלך פיתוח בכבד, התחדשות, פציעה¹⁹, LYVE1 ו- VEGFR3 באים לידי ביטוי על ידי תאי אנדותל כבד sinusoidal¹⁸. הצומת לימפה, LECs מזוהים באמצעות cytometry זרימה כמו אשכולות של בידול (CD) CD45 - CD31 +, podoplanin + (PDPN)¹⁶. עם זאת, גישה זו היא יותר מידי מינימלית כדי לבודד LECs בכבד מאז CD45 - CD31 + תאים ללכוד תאי אנדותל, האוכלוסייה הדומיננטית של תאי אנדותל כלי הדם בכבד הם LSECs. לפיכך, סמנים אחרים נדרשים כדי להבחין בין האוכלוסייה לץ נדיר מהאוכלוסייה LSEC שופע. CD16/32 (לידי ביטוי LSECs בוגר¹⁸) והן CD146 (נפוץ תא אנדותל כלי הדם סמן זה יוכפל לאחר המרתו לידי בתוך sinusoids הכבד תאי אנדותל sinusoidal הכבד²⁰ עם מעט שום הבעה על ידי הלימפה תאי אנדותל²¹) היו הסמנים המועמד.

לכן, אנחנו אופטימיזציה שיטה אנליטית והצגה של LECs בכבד באמצעות את לעיל סמנים CD45, CD31, CD146, CD16/32, PDPN עבור cytometry זרימה. אנו מתארים את השימוש collagenase הרביעי DNase 1, ההפרדה המכני לעיכול רקמת הכבד להשעיה תא בודד. אנו מתארים גם את השימוש iodixanol דחיסות צבע עבור הבידוד של תאים שאינם parenchymal (NPC), כדי לסלק פסולת הסלולר. לבסוף, באמצעות מספר סמני, נוכל לקבוע האסטרטגיה המגביל ביותר cytometry זרימה אופטימלית לזהות LECs מן הכבד עם PDPN כמו דה מרקר הדומיננטית.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של הקמפוס הרפואי של Anschutz אוניברסיטת קולורדו.

1. הכנת החומרים

1. להפוך את פתרון 5 מ"ג/מ"ל של DNase. אני בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
2. להכין תערובת העיכול על-ידי הוספת 5,000 U/mL של collagenase הרביעי EHAA מדיה של לחץ.
3. לחמם את תערובת עיכול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש.
4. להפוך של בידוד מאגר על-ידי הוספת 4.8% אלבומין שור (BSA) ומאוזנת 2 מ מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) של הנקס תמיסת מלח (HBSS).
5. להפוך את מאגר תאי הדם האדומים (RBC) פירוק על-ידי הוספת 100 מ מ אמוניום כלוריד, 10 מ מ KHCO₃ו- 0.1 מ"מ EDTA כדי מזוקקים H₂O.

2. הכנת השעיה תא בודד של כבד עכבר

1. המתת חסד את העכבר עם CO₂ ונקע בצוואר הרחם.
2. תרסיס למטה העכבר עם 70% אתנול להרטיב את פרוותו. להצמיד את העכבר הרגליים לקרש חיתוך.
3. באמצעות חיתוך מספריים לחתוך את העור, כ- 1 ס מ מעל פי הטבעת, נזהר לחתוך רק העור (בערך 1 מ מ). משוך את העור מהגוף עם מלקחיים במיתולגיות והכנס את המספריים בין העור לבין הצפק. פתח את המספריים כדי להפריד את העור הצפק, ואז לחתוך את העור של החתך בצוואר.
4. להצמיד את העור ללוח לנתיחה באמצעות סיכה אחת תחת כל זרוע ומעל כל רגל. . תעלה את שק הצפק וחותכים כלפי מעלה לכיוון הצוואר. תפוס את אונות הכבד, לחתוך בדיוק מתחת לעצם החזה.
   הערה: כדאי לשים לב אם כל הכבד ישמש עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC).
5. . לחתוך את הכבד, להסיר את הכבד של העכבר והנח אותו ב- 4 מיליליטר EHAA מדיה של לחץ.
6. באמצעות אזמל, חותכים הכבד ב ~ 1 מ"מ קוטר חתיכות.
7. להוסיף 500 µL של תערובת עיכול, µL 500 של DNase אני (2 מ"ג/מ"ל) עד הכבד.
8. דגירה הכבד למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר 15 דקות, מערבבים את הנוזל בעזרת פיפטה 5 מ.
9. לאחר 30 דקות של דגירה, להעביר את הדגימה מתעכל דרך מסננת 100 מיקרומטר צינור חרוטי 50 מ.
10. דחף בעדינות את החלקים הנותרים דרך המסנן עם הבוכנה של מזרק 1-mL.
11. רוחצים את המסנן עם 5 מ של בידוד מאגר את דחף בעדינות את הרקמות דרך מסננת בגב בוכנה של מזרק 1 מ"ל. חזור על פעולה זו עד המסנן נשטף עם 25 מ של מאגר בידוד.
12. Centrifuge התאים ב 400 x g עבור 5 דק בקפידה וארוקן את תגובת שיקוע.
13. Resuspend בגדר עם 4 מ של RBC פירוק מאגר. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
14. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של מאגר בידוד, צנטריפוגה ב 400 x g למשך 5 דקות.
15. לספור את התאים על hemocytometer כדי לקבוע את ספירת מלא כבד.
16. Resuspend התאים ב- 5 מ של 20% iodixanol ושכבה אותם עם 1 מ"ל ל- PBS.
17. Centrifuge התאים ב x 300 גרם למשך 15 דקות בלי בלם.
18. להסיר את שכבת בין מגניב של iodixanol ולמקם אותם, דרך מסנן 100 מיקרומטר, לתוך צינור חרוטי 50 מ.
19. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של מאגר בידוד, צנטריפוגה ב 400 x g למשך 5 דקות.
20. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 500 ל- PBS עם 2% סרום שור עוברית (FBS).

3. זרימה ניתוח Cytometric של תאים בודדים מן הכבד

1. לספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ, באמצעות אי-הכללה trypan blue כדי למדוד את התאים קיימא hemocytometer. להוסיף 10 µL של התאים µL 10 של trypan blue, מיד למקם אותם על hemocytometer ולספור את התאים הפועלים (לא כחול) תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, לחשב את מספר התאים לכל microliter.
2. Aliquot כ-5 מיליון של התאים nonparenchymal הנותרים לבאר בודדת של צלחת 96-ובכן.
3. Centrifuge התאים ב x 400 g למשך 5 דקות.
4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 90 ל- PBS עם 2% FBS.
5. להוסיף אנטי-CD45 (1:200), אנטי-CD146 (1:200), אנטי-CD31 (1:200), PDPN (1:200) מעורבבת עם µL 10 של 10 x 2.4G2 או אנטי-CD16/32 (1:200).
   הערה: אין לחסום Fc (2.4G2) נעשה שימוש כאשר נוגדן anti-CD16/32-שכותרתו הייתה בשימוש.
6. כדי לקבוע היכן צריך להיות מוגדר השערים חיוביים ושליליים, כוללים פלורסצנטיות מינוס הכתם (FMO) אחת עבור כל צבע ונוגדן שליטה isotype.
7. כדי לקבוע חיים לעומת תאים מתים, כתם עם סמן הכדאיות (למשל, רפאים אדומים 780). דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
8. לשטוף את התאים עם µL 100 ל- PBS עם 2% FBS.
9. השתמש aliquot קטן של תאים כדי לכוונן את ההגדרות לייזר ופיצוי על cytometer הזרימה. כתם התאים עם נוגדן כל fluorophore נפרדים, אחד ללא כל נוגדן.
   הערה: בהתאם cytometer זרימה בשימוש, יש להקים מטריצה פיצוי כדי להסיר חפיפה ספקטרלי.
10. למקם את הצינור מדגם על גבי החללית cytometer ו לאסוף ולהקליט כל האירועים.

4. ניתוח נתונים

1. מסתכלים על הצד-פיזור לעומת העבר-פיזור איזור, שער על תאים "חי" בהתבסס על הגודל, צפיפות, הכדאיות סמן צבע.
2. בשלב הבא, שימוש 510 סגול מבריק CD45 ו CD31 PerCp Cy5.5, שער על תאים CD45 - CD31 + שימוש פקדים isotype ו- FMO כדי לקבוע אוכלוסיות חיוביים ושליליים.
3. לבסוף, באמצעות CD146 v450 או FITC CD16/32 ו PDPN APC, לקחת את CD146 - PDPN + או CD16/32-PDPN + תאים, שוב באמצעות פקדי isotype ו- FMO, כדי לקבוע אוכלוסיות חיוביים ושליליים. תאים אלה הם LECs.

תוצאות

לימודי ניתוח lymphatics בכבד בעיקר השתמשו אימונוהיסטוכימיה כדי quantitate את התדירות ואת קוטר של כלי הלימפה בכבד. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת עבור הערכת LECs על בסיס תא-על ידי תאים-תאים או ביטוי של מספר סמנים, ציטוקינים, נוגדנים או גורמי שעתוק. לכן, שאלנו אם הכבד LECs יכול להיות מבודד מן ?...

Discussion

החשיבות הכללית של LECs הומאוסטזיס המערכת החיסונית, רגולציה לאחרונה הובא אור²⁵. רוב הספרים שפורסמו הלימפה מתמקד העור ואת בלוטות הלימפה; עם זאת, lymphatics פזורים ברחבי הגוף²⁶ ו, לכן, נדרש הבנתנו את החשיבות של איברים שונים. הנה אנחנו מראים שיטה שבה ניתן יהיה ללמוד LECs בכבד על ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clicks/EHAA media	Irvine Scientific	9195
Collagenase IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	Deoxyribonuclease 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)	BD biosciences	562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)	Biolegend	134706	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102420	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)	Biolegend	127410	Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)	Biolegend	101306	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)	Biolegend	101324	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye	TONBO biosceinces	3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)	Biolegened	402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)	Biolegend	400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)	ebioscience	1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)	R&D systems	FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)	abcam	ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)	Bio-rad	MCA497
BSA (fraction V)	Fischer	BP1600-100	Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride	Fischer	A687-500	for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate	Fischer	P184-500	for RBC Lysis buffer
Scalpel	Feather	2975#21
100 μm cell strainer	Fischer	22363549
2.4G2	in house/ATCC	ATCC HB-197	FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta biologicals	S11550
96 well plate	Corning	3788
6 well plate	Corning	3506
50 mL conical	Truline	TR2004
15 mL conical	Falcon	352196
1 mL Pipete tip	USA scientific	1111-2721
200 µL pipete tip	USA scientific	1110-1700
10 µL pipete tip	USA scientific	1111-3700
seriological 10 mL pipete	greiner bio-one	607107
seriological 5 mL pipete	greiner bio-one	606107
Cell incubator	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer	BD biosciences
Clinical Centrifuge	Beckman coulter		model X-14R