Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Zusammenfassung

In der Leber Lymphgefäße befinden sich innerhalb des Portals Dreiklang, und ihre beschriebene Funktion soll interstitielle Flüssigkeit aus der Leber, die Lymphknoten zu entfernen, wo Zelltrümmer und Antigene befragt werden. Wir sind sehr daran interessiert, zu verstehen wie das lymphatische Gefäßsystem in Entzündung und Immunzelle Funktion innerhalb der Leber beteiligt sein könnten. Jedoch sehr wenig veröffentlicht wurden zur Gründung Verdauung Protokolle für die Isolierung von lymphatische Endothelzellen (LECs) aus der Leber oder spezifischer Marker, die verwendet werden, um die Leber zu bewerten LECs pro Zelle. Daher haben wir eine Methode für die Verdauung und das Beflecken der Leber für die Beurteilung die LEC-Bevölkerung in der Leber optimiert. Wir sind zuversichtlich, dass die hier beschriebene Methode nützlich für die Identifizierung und Isolierung von LECs aus der Leber ist und stärkt unser Verständnis wie LECs auf die Leber Mikroumgebung reagieren.

Einleitung

Die Rolle der Lymphgefäße und LECs in der Leber ist nicht gut verstanden. Während Lymphgefäße finden Sie unter dem Portal Dreiklang aus der Leber¹ und Krankheit²auszubauen, ist sehr wenig über die Funktion und den Phänotyp der LECs innerhalb der Leber verstanden. Mit der Entdeckung von Markern, die in erster Linie auf LECs³gefunden werden, wird die Bedeutung dieser Zellen in verschiedene Gewebe Nischen in Homöostase und Krankheit eine bedeutende Lücke in unserem Verständnis füllen. LECs haben eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz in den Lymphknoten und metastasierten Tumoren durch die Interaktion direkt mit T Zellen^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs in den Lymphknoten können schützende Immunität über ihre Interaktionen mit wandernden dendritischen Zellen^14,15,16fördern. Daher gibt es mehrere Rollen für LECs möglicherweise spezifisch für die Gewebe und Interaktionen, in denen sie vertreten sind. Jedoch sehr wenig verstanden wie LECs mit Immunzellen im Gewebe interagieren oder LECs in verschiedenen Organsystemen Funktionsweise; so kann die Bewertung LECs auf einer Basis pro Zelle innerhalb der Leber oder andere Organe zu Fortschritte in der wie LECs Gewebe-spezifische Immunität Programm führen. Während ein Großteil der Literatur, die in der Leber auf LECs konzentriert Mikroskopie nutzt, um mit ein oder zwei Markierungen und Morphologie¹⁷LECs zu visualisieren, wurde sehr wenig getan, um speziell LECs anhand einer Zelle für Zelle Durchflusszytometrie, obwohl eine Studie bewerten Unterschiede zwischen sinusförmigen endothelial Zellen der Leber (LSECs) und LECs¹⁸bewerten. Möglichkeit, LEC Populationen in der Leber durch Durchflusszytometrie analysieren können für die eingehende Untersuchung der LEC Phänotyp bei normalen Homöostase oder Krankheit.

Um LECs durch Durchflusszytometrie zu bewerten, werden mehrere Oberflächenmarker benötigt. In der Regel sind LECs durch den Ausdruck von Prospero-bezogene Homeobox 1 (Prox-1), Lymphgefäßsystem endotheliale Hyaluronan Rezeptor 1 (LYVE1) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor Rezeptor 3 (VEGFR3) mit Mikroskopie visualisiert. Jedoch ist der Ausdruck dieser Marker in der Leber nicht auf LECs beschränkt. Prox-1 drückt sich häufig durch Hepatozyten während Leber Entwicklung, Regeneration und Verletzungen¹⁹, und LYVE1 und VEGFR3 durch die Leber sinusförmigen Endothelzellen¹⁸ausgedrückt werden. In den Lymphknoten werden LECs durch Durchflusszytometrie als Cluster der Differenzierung (CD) identifiziert CD45 - CD31 + und Podoplanin + (PDPN)¹⁶. Dieser Ansatz ist jedoch zu gering, LECs in der Leber zu isolieren, da CD45 - CD31 + Zellen werden Endothelzellen zu erfassen, und die überwiegende Bevölkerung von vaskulären endothelialen Zellen in der Leber LSECs sind. Daher sind andere Markierungen erforderlich, um die seltenen LEC Bevölkerung aus der reichlich LSEC Bevölkerung zu unterscheiden. CD16/32 (ausgedrückt durch ausgereifte LSECs¹⁸) und CD146 (eine gemeinsame vaskulären Endothelzellen Symbol, das sich überwiegend innerhalb der Leber Sinusoide geäußerten Leber sinusförmigen Endothelzellen²⁰ mit wenig bis kein Ausdruck von lymphatischen Endothelzellen²¹) wurden Kandidaten Marker.

Daher haben wir eine Methode zur Isolierung und Visualisierung LECs in der Leber, die mit den oben genannten Markierungen, CD45 CD31, CD146, CD16/32 und PDPN für Durchflusszytometrie optimiert. Wir beschreiben die Verwendung von Kollagenase IV, DNase 1 und mechanische Trenntechnik für Lebergewebe Verdauung in eine einzelne Zelle-Suspension. Wir beschreiben auch die Verwendung des Iodixanol Dichtegradient für die Isolierung von nicht-parenchymal Zellen (NPC) und Zelltrümmer zu beseitigen. Zu guter Letzt ermitteln mit mehreren Markern, wir die optimalen Fluss Cytometry gating Strategie LECs aus der Leber mit PDPN als die vorherrschende Marker zu identifizieren.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien

1. Machen Sie eine 5 mg/mL Lösung der DNase I Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
2. Machen Sie eine Mischung der Verdauung durch Zugabe von 5.000 U/mL der Kollagenbildung IV, klicken Sie auf die EHAA Medien.
3. Wärmen Sie die Verdauung Mischung bei 37 ° C für 30 min vor dem Gebrauch.
4. Machen eine Isolierung Puffer durch Zugabe von 4,8 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), Hanks ausgewogenen Salzlösung (HBSS).
5. Lyse der Erythrozyten (RBC) Puffer zu machen, durch Zugabe von Ammoniumchlorid 100 mM, 10 mM KHCO₃und 0, 1 mM EDTA, H₂O. destilliert

2. Vorbereitung einer einzelligen Suspension aus einer Maus-Leber

1. Die Maus mit CO₂ und zervikale Dislokation einschläfern.
2. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol zu sein Fell nass. Heften Sie der Maus Füße eine Dissektion Board.
3. Mit einer Dissektion Schere schneiden Sie die Haut ca. 1 cm über den After, achten Sie darauf, nur durch die Haut (ca. 1 mm) schneiden. Ziehen Sie die Haut vom Körper weg mit gezahnten Zangen und legen Sie die Schere zwischen Haut und Bauchfell. Öffnen Sie die Schere um das Peritoneum die Haut trennen und dann schneiden Sie die Haut vor dem Einschnitt an den Hals.
4. Heften Sie die Haut um die Dissektion-Board mit einem Pin unter jeden Arm und jedes Bein. Die Peritonealdialyse Sac hochziehen und nach oben in Richtung Hals geschnitten. Schnappen Sie sich die Lappen der Leber und schneiden nur unter dem Brustbein.
   Hinweis: Vorsicht ist geboten werden, wenn eines der Leber für Immunhistochemie (IHC) verwendet wird.
5. Um die Leber schneiden Sie und entfernen Sie die Leber von der Maus und legen Sie sie in 4 mL klicken Sie auf die EHAA Medien.
6. Mit einem Skalpell schneiden Sie die Leber in ~ 1 mm Durchmesser Stücke.
7. Hinzufügen von 500 µL der Verdauung Mischung und 500 µL der DNase I (2 mg/mL), um die Leber.
8. Inkubieren Sie die Leber für 30 min bei 37 ° c Mischen Sie nach 15 min die Flüssigkeit mit einer 5 mL-Pipette.
9. Übertragen Sie nach 30 min Inkubation verdaute Probe durch ein 100 µm-Sieb auf eine 50 mL konische Rohr.
10. Schieben Sie die restlichen Stücke durch den Filter mit den Kolben einer 1-mL-Spritze.
11. Waschen Sie den Filter mit 5 mL Isolierung Puffer und schieben Sie das Gewebe durch das Sieb mit der Rückseite des einen Kolben aus eine 1 mL Spritze. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Filter mit 25 mL Isolierung Puffer gewaschen wird.
12. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g , für 5 min. sorgfältig aus der Überstand abgesaugt.
13. Das Pellet mit 4 mL des RBC Lyse Puffer aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 5 min bei Raumtemperatur.
14. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 5 Minuten.
15. Zählen der Zellen auf eine Hemocytometer um die Anzahl der vollen Leber festzustellen.
16. Aufschwemmen Sie Zellen in 5 mL 20 % Iodixanol und Ebenen Sie anordnen mit 1 mL PBS.
17. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 15 min ohne Bremse.
18. Entfernen Sie die Schicht zwischen der PBS und der Iodixanol, und legen Sie sie, durch einen 100 µm-Filter in ein neues 50 mL konische Röhrchen.
19. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 5 Minuten.
20. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 500 µL PBS mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS).

(3) durchflusszytometrischen Analyse einzelner Zellen aus der Leber

1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer und einem Mikroskop verwenden Trypan blau Ausgrenzung, um lebensfähige Zellen zu messen. 10 µL Trypan blau 10 µL der Zellen hinzufügen und sofort auf ein Hemocytometer legen und die lebenden Zellen (nicht blau) unter dem Mikroskop zählen. Dann berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Mikroliter.
2. Etwa 5 Millionen Aliquot der verbleibenden Nonparenchymal Zellen in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 5 min.
4. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 90 µL PBS mit 2 % FBS.
5. Hinzufügen von Anti-CD45 (1: 200), Anti-CD146 (1: 200), Anti-CD31 (1: 200) und PDPN (1: 200) in 10 µL 10 x 2.4G2 oder Anti-CD16/32 (1: 200) verdünnt.
   Hinweis: Kein Fc-Block (2.4G2) diente als Anti-CD16/32-markierten Antikörper verwendet wurde.
6. Um festzustellen, wo positive und negative Toren festgelegt werden soll, gehören Sie eine Fluoreszenz minus 1 (FMO) Fleck für jede Farbe und einen Isotype Kontrolle Antikörper.
7. Um live gegen abgestorbene Zellen zu bestimmen, färben Sie mit einem Lebensfähigkeit Marker (z. B. Ghost rot 780). Inkubieren Sie die Zellen bei 4 ° C für 30 min.
8. Waschen Sie die Zellen mit 100 µL PBS mit 2 % FBS.
9. Verwenden Sie eine kleine aliquoten Zellen um die Einstellungen für Laser und Entschädigung auf das Durchflusszytometer anzupassen. Färben Sie die Zellen mit einem Antikörper zu jeder einzelnen Fluorophor und ohne irgendwelche Antikörper.
   Hinweis: Je nach dem Durchflusszytometer verwendet wird sollte eine Vergütungsmatrix eingerichtet werden, um spektrale Überlappung zu entfernen.
10. Legen Sie das Probenröhrchen auf die Cytometer Sonde und sammeln zeichnen Sie alle Ereignisse auf.

(4) Datenanalyse

1. Blick auf Seite-Streuung vs. Forward Scatter Gegend, Tor auf "live" Zellen basierend auf Größe und Granularität und Lebensfähigkeit Marker-Farbstoff.
2. Als Nächstes verwenden CD45 brillant violett 510 und CD31 PerCp Cy5.5, Tor auf die CD45 - CD31 +-Zellen mit dem Isotype Kontrollen und FMO um zu positive und negative Populationen zu bestimmen.
3. Zu guter Letzt mit CD146 v450 oder CD16/32 FITC und PDPN APC, nehmen Sie den CD146 - PDPN + oder CD16/32-PDPN +-Zellen, wieder mit Isotype Kontrollen und FMO, um positive und negative Populationen zu bestimmen. Diese Zellen sind die LECs.

Ergebnisse

Studien analysieren Leber Lymphgefäße haben in erster Linie Immunohistochemistry verwendet, um die Häufigkeit und den Durchmesser der Lymphgefäße in der Leber quantitate. Diese Methode erlaubt allerdings nicht für die Bewertung der LECs auf Basis einer Zelle für Zelle oder Ausdruck mehrerer Marker, Zytokine, Chemokine oder Transkriptionsfaktoren. Also, wir fragten ob Leber LECs isoliert aus der Leber werden konnte und mittels Durchflusszytometrie. Isolieren von Lymphknoten LECs Vor...

Diskussion

Die allgemeine Bedeutung der LECs immun Homöostase und Verordnung ist vor kurzem zum leichten²⁵gekommen. Ein Großteil der veröffentlichten lymphatischen Literatur konzentriert sich auf Haut und Lymphknoten; Allerdings Lymphgefäße findet man überall in den Körper-²⁶ und unser Verständnis ihrer Bedeutung in verschiedenen Organen ist also erforderlich. Hier zeigen wir eine Methode in der LECs in der Leber untersucht werden können auf eine Zelle für Zelle Basis ihren ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clicks/EHAA media	Irvine Scientific	9195
Collagenase IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	Deoxyribonuclease 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)	BD biosciences	562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)	Biolegend	134706	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102420	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)	Biolegend	127410	Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)	Biolegend	101306	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)	Biolegend	101324	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye	TONBO biosceinces	3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)	Biolegened	402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)	Biolegend	400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)	ebioscience	1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)	R&D systems	FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)	abcam	ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)	Bio-rad	MCA497
BSA (fraction V)	Fischer	BP1600-100	Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride	Fischer	A687-500	for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate	Fischer	P184-500	for RBC Lysis buffer
Scalpel	Feather	2975#21
100 μm cell strainer	Fischer	22363549
2.4G2	in house/ATCC	ATCC HB-197	FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta biologicals	S11550
96 well plate	Corning	3788
6 well plate	Corning	3506
50 mL conical	Truline	TR2004
15 mL conical	Falcon	352196
1 mL Pipete tip	USA scientific	1111-2721
200 µL pipete tip	USA scientific	1110-1700
10 µL pipete tip	USA scientific	1111-3700
seriological 10 mL pipete	greiner bio-one	607107
seriological 5 mL pipete	greiner bio-one	606107
Cell incubator	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer	BD biosciences
Clinical Centrifuge	Beckman coulter		model X-14R