JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в идентификации населения лимфатический эндотелиальных клеток в печени с помощью описанных маркеров. Мы используем коллагеназы IV и DNase и нежный мясорубки ткани, в сочетании с проточной цитометрии, чтобы определить собственный населения лимфатический эндотелиальных клеток.

Аннотация

В печени лимфатические сосуды находятся в пределах портала триады, и их описывается функция удаление интерстициальной жидкости из печени в лимфатические узлы где можно обследованных сотовой мусора и антигены. Мы очень заинтересованы в понимании, как лимфатический сосудистую могут быть вовлечены в воспаление и функция иммунных клеток в печени. Однако, очень мало был опубликован создание пищеварение протоколов для изоляция лимфатическую эндотелиальных клеток (LECs) из печени или определенных маркеров, которые могут быть использованы для оценки функции печени МГС на основе за клеток. Таким образом мы оптимизированный метод для пищеварения и окрашивание печени с целью оценить LEC населения в печени. Мы убеждены в том, что метод конспектированный здесь будет полезным для выявления и изоляции LECs из печени и укрепит наше понимание как LECs реагировать печень микроокружения.

Введение

Не хорошо понимают роль лимфатические сосуды и МГС в печени. В то время как лимфатические сосуды находятся в пределах портала Триада печени1 и расширять во время болезни2, очень мало понимается относительно функции и фенотип МГС в печени. С открытием маркеров, которые находятся главным образом на МГС3важность этих клеток в различных тканей ниши в гомеостаза и болезни будет заполнить значительный пробел в нашем понимании. МГС играют важную роль в поддержании периферийных терпимости в лимфатических узлов и метастатические опухоли, взаимодействуя непосредственно с T клетки4,5,6,,78, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. МГС в лимфатических узлов может способствовать защитный иммунитет через их взаимодействие с мигрирующие дендритные клетки14,,1516. Таким образом существует несколько ролей для LECs, которые могут быть специфическими для тканей и взаимодействия, в которых они присутствуют. Однако очень мало понимается как LECs взаимодействуют с иммунных клеток в тканях или как LECs функционируют в различных органов и систем; Таким образом оценки МГС на основе за клеток в печени или других органов может привести к достижения в LECs, как программы ткани конкретных иммунитета. Хотя большая часть литературы, которая сосредотачивается на МГС в печени использует микроскопии для визуализации LECs, используя один или два маркеры и морфология17, очень мало было сделано для конкретно оценить МГС на основе по ячейкам с помощью проточной цитометрии, хотя одно исследование оценить различия между синусоидального эндотелиальных клеток печени (LSECs) и МГС18. Возможность анализировать LEC населения в печени подачей cytometry позволяет для углубленного изучения LEC фенотип во время нормальной гомеостаза или болезни.

Чтобы оценить LECs подачей cytometry, необходимы несколько поверхностных маркеров. Как правило LECs визуализируются выражение связанных с Просперо гомеобокс 1 (Prox-1), лимфатический сосуд эндотелиальной гиалуроновая кислота рецепторов 1 (LYVE1) или Сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептор 3 (VEGFR3) с помощью микроскопии. Однако в печени, выражение этих маркеров не ограничивается МГС. Prox-1 широко выражается гепатоцитов во время регенерации печени развития и травмы19, и LYVE1 и VEGFR3 являются выраженные эндотелиальных клеток печени синусоидального18. В лимфоузел, LECs идентифицируются с помощью проточной цитометрии как кластеры дифференциации (CD) CD45 - CD31 + и podoplanin + (PDPN)16. Однако этот подход является слишком минимальной, чтобы изолировать МГС в печени, так как CD45 - CD31 + клетки будет захватить эндотелиальных клеток, а преобладающее население сосудистой эндотелиальных клеток в печени LSECs. Таким образом другие маркеры необходимо различать редких LEC населения с обильным LSEC населения. CD16/32 (выраженные Зрелые LSECs18) и CD146 (общий сосудистый эндотелиальных клеток маркер, преимущественно, выраженные в печени синусоиды20 синусоидального эндотелиальных клеток печени с практически не выражение лимфатической эндотелиальные клетки21) были кандидат маркеров.

Таким образом мы оптимизированный метод для изоляции и визуализации МГС в печени, используя выше маркеров, CD45, CD31, CD146, CD16/32 и PDPN для проточной цитометрии. Мы описывают использование коллагеназы IV, DNase 1 и механического разделения для переваривания ткани печени в одну ячейку подвеска. Мы также описывают использование градиента плотности iodixanol для изоляции не Паренхиматозный клеток (NPC) и ликвидации сотовой мусора. Наконец мы с использованием нескольких маркеров, определить оптимальный поток цитометрии стробирования стратегию для выявления LECs из печени с PDPN как основной маркер.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) медицинского городка университета Колорадо Anschutz.

1. Подготовка материалов

  1. Сделать 5 мг/мл раствора DNase I в фосфат амортизированное saline (PBS).
  2. Сделайте смесь пищеварение , добавив 5000 ед/мл коллагеназы IV нажмите на EHAA СМИ.
  3. Теплая смесь пищеварение при 37 ° C за 30 мин до использования.
  4. Сделать в изоляции буфера , добавив 4,8% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS).
  5. Сделать буфера lysis эритроцитов (РБК) , добавив, что хлорид аммония 100 мм, 10 мм KHCO3и ЭДТА 0,1 мм для дистиллированной H2O.

2. подготовка одной ячейки подвеска из печени мыши

  1. Усыпить мыши с CO2 и шейки матки дислокации.
  2. Спрей вниз мыши с 70% этанол намочить его мех. Прикрепить мышь ноги на доску рассечение.
  3. Рассечение ножницами вырезать кожу около 1 см выше ануса, стараясь резать только через кожу (около 1 мм). Потяните кожу от тела с зубчатым щипцами и вставьте ножницы между кожей и брюшины. Откройте ножницы, чтобы отделить кожу от брюшины и, затем, порезать кожу от разреза на шее.
  4. PIN-код кожи в Правление рассечение, используя один контактный под каждой руки и над каждой ногой. Подтянуть перитонеальный sac и отрезать вверх к шее. Grab долей печени и вырезать чуть ниже грудины.
    Примечание: Следует если любой из печени будет использоваться для иммуногистохимии (IHC).
  5. Вырезать вокруг печени и удалить печень от мыши и поместить его в 4 мл нажмите EHAA средств массовой информации.
  6. С помощью скальпеля, вырезать печени в ~ 1 мм диаметр штук.
  7. Добавьте 500 мкл смеси пищеварение и 500 мкл DNase I (2 мг/мл) к печени.
  8. Инкубировать печени для 30 минут при 37 ° C. После 15 минут смешайте с помощью пипетки 5 мл жидкости.
  9. После 30 минут инкубации передать переваривается образца через стрейнер 100 мкм в 50 мл Конические трубки.
  10. Аккуратно вставьте оставшиеся части через фильтр с поршень шприца 1 мл.
  11. Промойте фильтр с 5 мл буфера изоляции и аккуратно вставьте ткани через сито с задней части плунжера от 1 мл шприц. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока фильтр промывают 25 мл буфера изоляции.
  12. Центрифуга клетки на 400 x g за 5 мин тщательно аспирационная покинуть супернатант.
  13. Ресуспензируйте лепешка с 4 мл буфера lysis РБК. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 5 мин.
  14. Вымойте клетки с 10 мл буфера изоляции и центрифуги на 400 x g за 5 мин.
  15. Подсчет ячеек на Горяева для определения полной печени.
  16. Ресуспензируйте клетки в 5 мл 20% iodixanol и слой их с 1 мл раствора PBS.
  17. Центрифуга клетки на 300 x g 15 мин без тормоза.
  18. Удалите слой между PBS и iodixanol и поместите их, через фильтр 100 мкм, в новой 50 мл Конические трубки.
  19. Вымойте клетки с 10 мл буфера изоляции и центрифуги на 400 x g за 5 мин.
  20. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл PBS с 2% плода бычьим сывороточным (ФБС).

3. анализ гранулярных клеток одного из печени потока

  1. Подсчет количества ячеек с помощью микроскопа, с помощью исключения Трипановый синий для измерения жизнеспособных клеток и Горяева. Добавить 10 мкл клеток 10 мкл Трипановый синий и немедленно разместить их на Горяева и количество живых клеток (не голубые) под микроскопом. Затем вычислите количество клеток / мкл.
  2. Алиготе приблизительно 5 миллионов оставшихся nonparenchymal клеток в одну скважину 96-луночных плиты.
  3. Центрифуга клетки на 400 x g за 5 мин.
  4. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 90 мкл PBS с 2% FBS.
  5. Добавьте анти CD45 (1: 200), анти CD146 (1: 200), анти CD31 (1: 200) и PDPN (1: 200) разводят в 10 мкл 10 x 2.4G2 или анти CD16/32 (1: 200).
    Примечание: Блок не Fc (2.4G2) был использован при использовании анти CD16/32-обозначенного антитела.
  6. Чтобы определить, где следует установить позитивные и негативные ворота, включают флуоресценции минус один (FMO) пятно для каждого цвета и управления isotype антитела.
  7. Чтобы определить живой против мертвых клеток, пятно с маркером жизнеспособности (например, призрак красный 780). Инкубируйте клетки на 4 ° C на 30 мин.
  8. Вымыть клетки с 100 мкл PBS с 2% FBS.
  9. Используйте небольшое Алиготе клеток для лазерных и компенсации настройки на проточный цитометр. Пятно клетки с антитело для каждого индивидуального Флюорофор и один без каких-либо антитела.
    Примечание: В зависимости от проточный цитометр используется следует создать матрицу компенсации для удаления спектрального наложения.
  10. Поместите образец трубу на цитометр зонд и собирать и записывать все события.

4. анализ данных

  1. Глядя на стороне точечной против вперед точечной районе, ворота на «живых» клетки, основанные на размер и степень детализации и жизнеспособности маркер красителя.
  2. Далее используя CD45 блестящий фиолетовый 510 и CD31 PerCp Cy5.5, ворота на CD45 - CD31 + клеток с использованием изотипа элементы управления и FMO определить положительные и отрицательные населения.
  3. Наконец, используя CD146 v450 или FITC CD16/32 и PDPN APC, возьмите CD146 - PDPN + или CD16/32-PDPN + клеток, снова с использованием изотипа элементов управления и FMO, чтобы определить положительные и отрицательные населения. Эти клетки являются Мик.

Результаты

Исследования, анализ печени лимфатические использовали главным образом иммуногистохимия чтобы quantitate частоты и диаметр лимфатических сосудов в печени. Однако этот метод не позволяет для оценки МГС на основе по ячейкам или выражение несколько маркеров, цитокины, chemokine...

Обсуждение

Общее значение МГС в иммунного гомеостаза и регулирование недавно пришло света25. Большая часть опубликованных лимфатический литературы фокусируется на кожу и лимфатические узлы; Однако лимфатические находятся во всем теле26 и, таким образом, необходимо наше ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить GI и печени Innate иммунных программы за финансовую поддержку этого проекта. B.A.J.T. также финансируется R01 AI121209.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Clicks/EHAA mediaIrvine Scientific9195
Collagenase IVWorthington Biochemical corporationLS004188
DNase IWorthington Biochemical corporationLS002145Deoxyribonuclease 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)BD biosciences562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)Biolegend134706Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)Biolegend102420Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)Biolegend127410Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)Biolegend101306Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)Biolegend101324Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dyeTONBO biosceinces3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)Biolegend400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)ebioscience1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)R&D systemsFAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)abcamab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)Bio-radMCA497
BSA (fraction V)FischerBP1600-100Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serumJackson Immunoresearch017-000-121
Donkey SerumJackson Immunoresearch017-000-121
EDTAVWRE177Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium ChlorideFischerA687-500for RBC Lysis buffer
Potassium BicarbonateFischerP184-500for RBC Lysis buffer
ScalpelFeather2975#21
100 μm cell strainerFischer22363549
2.4G2in house/ATCCATCC HB-197FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)Corning21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta biologicalsS11550
96 well plateCorning3788
6 well plateCorning3506
50 mL conicalTrulineTR2004
15 mL conicalFalcon352196
1 mL Pipete tipUSA scientific1111-2721
200 µL pipete tipUSA scientific1110-1700
10 µL pipete tipUSA scientific1111-3700
seriological 10 mL pipetegreiner bio-one607107
seriological 5 mL pipetegreiner bio-one606107
Cell incubatorFischerHeracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometerBD biosciences
Clinical CentrifugeBeckman coultermodel X-14R

Ссылки

  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143IV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены