림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

요약

이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.

초록

간, 내 림프 혈관 포털 깡패 내에서 발견 되 고 그들의 설명한 기능 세포 파편과 항을 조사 수 있는 림프절을 간에서 틈새 액체를 제거 하는. 우리는 림프 맥 관 구조 염증 및 간 내에서 면역 세포 기능에 관여 하는 수도 있습니다 어떻게 이해에 매우 관심이 다입니다. 그러나, 아주 작은 게시 된 간 또는 간 평가 하는 데 사용할 수 있는 특정 마커 (LECs)의 림프 내 피 세포의 고립에 대 한 소화 프로토콜 설정 LECs 당 셀 기준. 따라서, 우리는 소화와 간에서 LEC 인구를 평가 하기 위해 간 얼룩에 대 한 방법을 최적화 합니다. 우리는 여기에 설명 된 방법을 식별 및 간에서 LECs의 격리에 대 한 도움이 될 것입니다 LECs 간 microenvironment에 대응 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 강화할 것 이다 확신.

서문

간에서 림프 혈관 및 LECs의 역할은 잘 이해 되지. 림프 혈관 간¹ 의 포털 3 인조 내의 질병²중 확장 하는 동안 아주 작은 기능 및 간 내 LECs의 표현 형에 관한 이해 된다. LECs³에 주로 발견 되는 마커의 발견과 항상성 및 질병에 다른 조직 틈새 내의 이러한 셀의 중요성 우리의 이해에 중요 한 격차를 채울 것입니다. LECs는 T 세포^4,,56,7,8, 와 직접 상호 작용 하 여 림프 노드 및 전이성 종양 주변 공차를 유지 하는 주요 역할 ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13}. 림프 노드에서 LECs 철새 수지상 세포^14,,1516와 그들의 상호 작용을 통해 보호 면역을 홍보할 수 있습니다. 따라서, 특정 조직에 있는 그들은 존재 하는 상호 작용 수 있는 LECs에 대 한 여러 역할이 있습니다. 그러나, 아주 작은 LECs 조직에서 면역 세포 상호 작용 하는 방법 또는 다른 기관 체계; LECs 작동 하는 방법에 대 한 이해는 따라서, 간 또는 다른 장기에서 세포 당 기준 LECs 평가 어떻게 LECs 조직 특정 면역 프로그램에서 발생할 수 있습니다. 문학에 초점을 맞춘 LECs 간에서 많이 LECs 하나 또는 두 개의 마커 및 형태학¹⁷를 사용 하 여 시각화를 현미경을 사용 하 여, 하는 동안 아주 작은 일 하고있다 특히 cytometry, 비록 한 연구를 사용 하 여 셀에 의해 셀 별로 LECs를 평가 하 한 간 사인 내 피 세포 (LSECs), LECs¹⁸간의 차이 평가. Cytometry 여 간에서 LEC 인구를 분석할 수 있는 정상적인 항상성 또는 질병 동안 LEC 표현 형의 심도 있는 연구에 대 한 수 있습니다.

LECs cytometry로를 평가 하려면 여러 표면 마커 필요 합니다. 일반적으로, LECs 지주 님 관련 homeobox 1의 표현 (Prox-1), 림프 혈관 내 피 hyaluronan 수용 체 1 (LYVE1) 또는 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 3 (VEGFR3) 현미경을 사용 하 여 시각화 됩니다. 그러나,이 간,이 마커의 식 LECs 제한 되지 않습니다. Prox 1 널리 간 개발, 재생, 및 부상¹⁹, hepatocytes에 의해 표현 하 고 LYVE1 및 VEGFR3¹⁸간 사인 내 피 세포 의해 표현 됩니다. 림프절, LECs cytometry 차별화 (CD)의 클러스터로 사용 하 여 식별 됩니다 CD45-CD31 +, podoplanin + (PDPN)¹⁶. 그러나,이 방법은 너무 CD45-CD31 + 세포는 내 피 세포와 간에서 혈관 내 피 세포의 주된 인구는 LSECs 이후 간에서 LECs을 최소 이다. 따라서, 다른 마커는 풍부한 LSEC 인구에서 드문 LEC 인구 구분 필요 합니다. CD16/32 (성숙 LSECs¹⁸에 의해 표현)와 CD146 (일반적인 혈관 내 피 세포 마커를 주로 림프 여 식이 없는 거의 간 사인 내 피 세포²⁰ 여 간 사인 내 표현 내 피 세포²¹) 후보 마커를 했다.

따라서, 우리는 분리 하 고 간 cytometry에 대 한 위의 마커, CD45, CD31, CD146, CD16/32, 및 PDPN를 사용 하 여에서 LECs을 시각화 하는 방법을 최적화 합니다. 우리는 콜라 4의 사용, DNase 1, 및 단일 셀 서 스 펜 션에 간 조직 소화에 대 한 기계적 분리 설명합니다. 우리는 또한 세포질 파편을 제거 하 고 비 parenchymal 세포 (NPC)의 분리에 대 한 iodixanol 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 설명 합니다. 주된 마커로 PDPN 간에서 LECs을 식별 하는 최적의 흐름 cytometry 제어 전략을 결정 마지막으로, 여러 개의 마커를 사용 하 여, 우리.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 콜로라도 대학 Anschutz 의료 캠퍼스의 승인 되었습니다.

1입니다. 자료의 준비

1. 5 mg/mL 솔루션 DNase의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 내가.
2. 클릭의 EHAA 미디어 콜라 IV의 5000 U/mL을 추가 하 여 소화 혼합물 을 확인 합니다.
3. 사용 하기 30 분 전에 37 ° C에서 소화 혼합 따뜻한.
4. 4.8% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 행 크 스를 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 균형 소금물 (HBSS) 추가 하 여 절연 버퍼 를 확인 합니다.
5. 염화 암모늄 100 mM, 10 mM KHCO₃및 0.1 m m EDTA를 H₂o. 소 주를 추가 하 여 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼를 확인

2. 마우스 간에서 단일 세포 현 탁 액의 준비

1. CO₂ 와 자 궁 경부 전위 마우스 안락사
2. 그것의 모피를 젖은 70% 에탄올과 마우스 아래로 스프레이. 마우스의 고정 해 부 보드 발.
3. 해 부가 위를 사용 하 여 피부 피부 (약 1 m m)만 극복 하 게 주의 되 고 항문 위에 약 1cm를 잘라. 이빨된 집게와 몸 떨어져 피부를 당겨 하 고 피부와 복 막 사이 위를 삽입 합니다. 복에서 피부를 분리 하 고, 다음, 목에 절 개에서 피부를 잘라가 위를 엽니다.
4. 각각의 팔 아래 및 각 다리 위에서 하나의 핀을 사용 하 여 해 부 보드에 피부를 고정 합니다. 복 주머니를 올려 고 목으로 위쪽으로 잘라. 간 엽을 흉 골 바로 아래를 잘라.
   참고: 한다 주의 간의 immunohistochemistry (IHC) 사용 될 것입니다.
5. 간 주위와 마우스에서 간 제거 잘라내어 클릭의 EHAA 미디어의 4 mL에 배치.
6. 메스를 사용 하 여 간 ~ 1 m m에서 직경 조각 잘라.
7. 추가 소화 혼합물의 500 µ L 500 µ L는 DNase의 간 난 (2 mg/mL).
8. 37 ° c.에 30 분 간 품 어 15 분 후 5 mL 피 펫을 사용 하 여 액체 믹스.
9. 외피의 30 분 후 50 mL 원뿔 튜브를 100 µ m 스 트레이너를 통해 소화 샘플을 전송.
10. 부드럽게 필터 1 mL 주사기의 플런저를 통해 남은 조각을 밀어.
11. 절연 버퍼의 5 mL로 필터를 세척 하 고 1 mL 주사기에서 조직 플런저의 뒷면으로 스 트레이너를 통해 가볍게 눌러. 이 필터는 절연 버퍼의 25 mL로 씻어 때까지 반복 합니다.
12. 5 분은 신중 하 게는 상쾌한에서 발음에 대 한 400 x g 에서 세포를 원심.
13. RBC 세포의 용 해 버퍼의 4 mL와 펠 릿 resuspend 5 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.
14. 절연 버퍼 및 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기의 10 mL로 세포 세척.
15. 전체 간 수를 확인 하려면 hemocytometer 셀을 계산 합니다.
16. Resuspend 20 %iodixanol 5 ml에서는 세포 고 1 mL의 PBS로 레이어.
17. 세포는 브레이크 없이 15 분 300 x g 에서 원심
18. PBS는 iodixanol 사이 레이어를 제거 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 100 µ m 필터를 통해 그들을 배치.
19. 절연 버퍼 및 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기의 10 mL로 세포 세척.
20. 삭제는 상쾌한 고 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 PBS의 500 µ L에 셀 resuspend.

3. 간에서 단일 세포의 Cytometric 분석 흐름

1. Hemocytometer 고 trypan 블루 제외를 사용 하 여 측정 가능한 세포를 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. Trypan 블루의 10 µ L를 셀의 10 µ L을 추가 하 고 즉시는 hemocytometer에 넣어 현미경 (하지 블루) 라이브 셀. 그런 다음, microliter 당 셀의 수를 계산 합니다.
2. 약 수 약 5 백만 96 잘 접시의 단일 우물으로 남아 있는 nonparenchymal 세포의.
3. 5 분에 대 한 400 x g 에서 셀 원심
4. 삭제는 상쾌한 고 2%와 PBS의 90 µ L 셀 resuspend FBS.
5. 안티-CD45 (1: 200), 안티-CD146 (1: 200), 안티-CD31 (1: 200)을 추가 하 고 PDPN (1: 200) 2.4G2 또는 안티-CD16/32 (1: 200) x 10의 10 µ L에 희석.
   참고: 안티 CD16/32-표시 된 항 체 사용 되었다 때 아니 Fc 블록 (2.4G2) 사용 되었다.
6. 긍정적이 고 부정적인 게이츠 설정할 위치를 확인 하려면 각 색상 및 항 체 isotype 컨트롤 1 (FMO) 얼룩 빼기 형광을 포함 합니다.
7. 라이브 대 죽은 세포를 확인 하려면 생존 표시 (예, 귀신 빨간 780)와 함께 얼룩. 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 품 어.
8. 2%와 PBS의 100 µ L로 세포 세척 FBS.
9. 셀의 작은 약 수를 사용 하 여 교류 cytometer에서 레이저와 보상 설정을 조정할. 각 개별 fluorophore와 어떤 항 체 없이 하나의 항 체와 세포 얼룩.
   참고: 사용 되 고 교류 cytometer 따라 보상 매트릭스 스펙트럼 중복 제거를 설립 되어야 합니다.
10. Cytometer 프로브에 샘플 튜브를 배치 하 고 수집 하 고 모든 이벤트를 기록.

4. 데이터 분석

1. 측면-분산형 지역 대 앞으로 피해 지역에서 찾고, 크기와 단위 생존 마커 염료에 따라 "라이브" 셀 게이트.
2. 다음, CD45 화려한 바이올렛 510과 CD31 PerCp Cy5.5, CD45-CD31 + 셀을 긍정적이 고 부정적인 인구 isotype 컨트롤 및 FMO를 사용 하 여 게이트를 사용 합니다.
3. 마지막으로, CD146-PDPN + 또는 CD16/32를 걸릴 CD146 v450 또는 CD16/32 FITC와 PDPN APC를 사용 하 여-PDPN + 셀, 사용 하 여 다시 isotype 컨트롤 및 FMO, 긍정적이 고 부정적인 인구 확인 하. 이 세포는 LECs는.

결과

간 lymphatics를 분석 하는 연구는 주로 주파수와 간에서 림프 혈관의 직경을 quantitate 하 immunohistochemistry를 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 셀에 의해 셀 기준 LECs의 평가 대 한 또는 여러 마커, cytokines, 발산, 또는 녹음 방송 요인의 표현에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 우리는 물었다 간 여부 LECs 간 으로부터 격리 될 수 있고 cytometry 사용 하 여 평가. 림프절 LECs 분리 이...

토론

빛²⁵LECs의 전반적인 중요성 면역 항상성 그리고 규칙에 최근에 왔다. 게시 된 림프 문학의 많은 피부와 림프절;에 초점을 맞추고합니다 그러나, lymphatics²⁶ 신체 걸쳐 발견 되 고, 따라서, 다른 기관에 그들의 중요성의 우리의 이해는 필요 하다. 여기 우리가 다른 표면 마커, cytokines, 발산, 및 녹음 방송 요인 등 세포내 단백질의 그들의 동시 표현 이해 하기 셀에 의?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clicks/EHAA media	Irvine Scientific	9195
Collagenase IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	Deoxyribonuclease 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)	BD biosciences	562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1)	Biolegend	134706	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390)	Biolegend	102420	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)	Biolegend	127410	Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)	Biolegend	101306	Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93)	Biolegend	101324	Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye	TONBO biosceinces	3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)	Biolegened	402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)	Biolegend	400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)	ebioscience	1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322)	R&D systems	FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)	abcam	ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)	Bio-rad	MCA497
BSA (fraction V)	Fischer	BP1600-100	Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride	Fischer	A687-500	for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate	Fischer	P184-500	for RBC Lysis buffer
Scalpel	Feather	2975#21
100 μm cell strainer	Fischer	22363549
2.4G2	in house/ATCC	ATCC HB-197	FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta biologicals	S11550
96 well plate	Corning	3788
6 well plate	Corning	3506
50 mL conical	Truline	TR2004
15 mL conical	Falcon	352196
1 mL Pipete tip	USA scientific	1111-2721
200 µL pipete tip	USA scientific	1110-1700
10 µL pipete tip	USA scientific	1111-3700
seriological 10 mL pipete	greiner bio-one	607107
seriological 5 mL pipete	greiner bio-one	606107
Cell incubator	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer	BD biosciences
Clinical Centrifuge	Beckman coulter		model X-14R