A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
الكشف على أساس الصفائح الدموية من أكسيد النيتريك في الدم عن طريق قياس الفسفرة بسب
In This Article
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لمعالجة الاستخدام المحتمل للصفائح الدموية كجهاز استشعار حساسة للغاية من أكسيد النيتريك في الدم. ويصف إعداد الصفائح الدموية الأولية واستخدام النيتريت وخلايا الدم الحمراء deoxygenated كمولدات أكسيد النيتريك.
Abstract
الصفائح الدموية هي مكونات الدم المسؤولة عن تخثر الدم السليم. وينظم وظيفتها عالية مسارات مختلفة. واحد من أقوى وكلاء فعال في الأوعية، أكسيد النيتريك (لا)، يمكن أن تعمل أيضا كمثبط قوي لتجميع الصفائح الدموية. مباشرة لا الكشف في الدم صعبة للغاية نتيجة لها مفاعليه عال مع الهيموغلوبين الخلية الحرة التي تحد من لا فترة نصف العمر للنطاق ميلي ثانية. حاليا، أي تغييرات بعد تدخلات وتقدر فقط استناداً إلى التغييرات المقاسة والنتريت والنترات (أعضاء المسار الأيضي النترات والنتريت-لا). دقيقة، هذه القياسات يتم بدلاً من ذلك من الصعب تفسير لا تغييرات، بسبب نتريت الأساس الطبيعي عالية مقارنة النسبة الفعلية والنترات مستويات عدة أوامر من حجم أكبر من التغيرات المتوقعة ليس في حد ذاته. ولذلك، تطوير أساليب بسيطة وغير المباشرة التي سوف تسمح بالكشف عن أي مباشرة أمر طال انتظاره. ويعالج هذا البروتوكول استخدام محتمل للصفائح الدموية كدرجة عالية من الحساسية لا جهاز استشعار في الدم. فهو يصف الصفيحات الأولية الغنية البلازما (PRP) والاستعدادات الصفيحات غسلها واستخدام النيتريت وخلايا الدم الحمراء deoxygenated لا المولدات. يستخدم للكشف عن وجود رقم الفسفرة بسب في سيرين 239 (فبسبSer239) حقيقة أن عالية يتم التعبير عن البروتين بسب في الصفائح الدموية وأنه هو فوسفوريلاتيد سريعاً عندما لا يتم هذا يؤدي إلى فرصة فريدة من نوعها لاستخدام هذا المسار للكشف عن وجود لا مباشرة في الدم.
Introduction
الصفائح الدموية هي شظايا خلية صغيرة على شكل قرص المستمدة من ميجاكاريوسيتيس التي حاسمة بالنسبة تخثر الدم. تتالي التخثر هو بدأها مختلف الجزيئات النشطة بيولوجيا (مثل الكولاجين أو ADP)، أفرج عنه بعد إصابة جدار الأوعية الدموية. يمكن تعديل عملية تخثر الدم، بين مختلف المستجيبة بأكسيد النيتريك (لا). لا، بطبيعة الحال التي تنتجها خلايا الثدييات، واحدة من الإشارات الفيزيولوجية الأكثر تنوعاً. أنها بمثابة وعائي قوية والعصبي والمغير المناعي، غيض من فيض مهامها العديدة. في مجرى الدم، كما لا يساعد على تنظيم مدى تخثر الدم عن طريق تثبيط الصفيحات التجميع. أحد المصادر الأكثر احتمالاً لا في مجرى الدم هو النترات، أيون غير عضوية التي ثبت ليكون بمثابة مقدمة لرقم التفاعل مع خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، يتم تقليل النيتريت إلى لا وهو تتأكسد ديوكسيهب ميثيموجلوبين (ميثب)1. أي إصدار من كرات الدم الحمراء هو فعال في الأوعية ويسبب فاسوريلاكسيشن2. هذا المسار الحد النتريت بديل لا مسار الجيل، تعمل جنبا إلى جنب مع وتكميل الكلاسيكية لا يوجد مسار جيل ببطانية أكسيد النيتريك synthase في ظروف التاكسج.
الصفائح الدموية نفسها ليست قادرة على تقليل النيتريت في لا ولكن حساسة جداً لوجودها. في الصفائح الدموية سليمة، لا في نانومولار نطاق يزيد المركب (المفوضية الأوروبية50 = 10 نانومتر) والفسفره بسب (المفوضية الأوروبية50 = 0.5 nM)3. ولذلك، قد الصفائح الدموية بمثابة جهاز استشعار ممتازة تخفيض النترات بكرات الدم الحمراء ولا إطلاقها في الدم. وهناك العديد من الأساليب التي يمكن أن تقيس مباشرة مدى تنشيط الصفائح الدموية--مثل أجريجوميتري وثرومبولاستوجرافي (الأرقام)4،5. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق كميات كبيرة بدلاً من المواد والأجهزة المتخصصة باهظة الثمن. وأيضا الممكنة لمراقبة أحداث المصب، بعد لا يتم تحريرها من كرات الدم الحمراء، استخدام التغييرات في التعبير البروتين سطح الصفيحات – مثل سيليكتين ف6. لا كما هو معروف إلى زيادة كمية المركب في الصفائح الدموية7. سابقا، استخدمنا المركب لرصد لا الإفراج في الدم بعد التخفيض نتريت deoxygenated ربك8. وهذا يثبت بطريقة حساسة للغاية؛ ومع ذلك، المركب جزيء لم تدم طويلاً والكشف عنها ينطوي على عمالة مكثفة. هناك إمكانية أخرى، المبينة في البروتوكول المقدم، يستخدم الفسفرة والرمات حفزت وعائي (بسب)-البروتين الكشف عن وجود أي في الدم. بسب هو ركيزة للبروتين كيناز ز التنشيط، الذي هو فوسفوريلاتيد على التفاعل مع أي من خلال المسار المركب sGC/9. يحدث الاكتشاف VASP الفسفرة منخفضة جداً دون أي تركيزات، التي يمكن أن تجعل جهاز كشف حساس جداً لعدم وجود الصفائح الدموية في الدم. وأعرب عن بسب عالية في الصفائح الدموية، ولكن ليس في خلايا الدم الأخرى، مما يسمح لمتابعة الأحداث التي تضم10من الصفائح الدموية بشكل انتقائي.
والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول وصف الطريقة بالتفصيل للكشف عن لا الإفراج في الدم كله استخدام تفاعله مع الصفائح الدموية برصد VASP الفسفرة11،12. وصف الأسلوب يسمح الاكتشاف المبكر لانخفاض لا تركيزات-نظرياً في نطاق nanomolar مما يجعل هذا البروتوكول أكثر حساسية من تصميم المركب، نتيجة لاستخدام التقنيات القياسية لطخة غربية يمكن تحقيقها في معظم المختبرات إعدادات.
Protocol
ملاحظة: وتم الحصول على عينات دم من بنك الدم المعاهد الوطنية للصحة (الاتحاد الدولي للرجبى اعتمد البروتوكول: 99-CC-0168).
1-الدم عينة إعداد
ملاحظة: لتفادي تنشيط الصفائح الدموية وسحب الدم ببطء وتخلط برفق مع سترات بعكس الأنبوبة عدة مرات.
-
إعداد البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP)
- رسم 30-50 مل دم استخدام ز 20 أو أكبر قطر الإبرة، وإضافة إلى أنبوب يحتوي على سترات الصوديوم (3.8 في المائة) في نسبة 1:9 أو حمض سترات الدكستروز (ACD) (سترات صوديوم 85 ملم، وحمض الستريك 66.6 مم، الجلوكوز 111 مم، الرقم الهيدروجيني 4.5) بنسبة 1:6.
- الكوة 5 مل من الدم كله الطازجة التي تم جمعها في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل فارغة. الطرد المركزي الدم كله في 120 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعناية جمع المادة طافية المحتوية على الصفائح الدموية (البلازما الغنية بالصفائح الدموية، الحزب الثوري) من الجزء العلوي ماصة بلاستيكية نقل.
ملاحظة: الحزب الثوري الشعبي من الخطوة 1-1-3 جاهز للاستخدام في التجارب أو غسلها لمزيد من المعالجة لإعداد الصفائح الدموية. بيليه الناعمة التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.1.2) يحتوي على خلايا الدم الحمراء والخلايا البيضاء ويمكن أن تكون مواصلة تنقية للحصول على غسلها من خلايا الدم الحمراء (RBC) – انظر الخطوة 1.3. التجربة يحتاج إلى أن يتم الانتهاء من داخل ح 2 بعد رسم الدم. عند جمع الحزب الثوري (طافية)، تجنب جمع بافي الكريات البيضاء التي تحتوي على شعار المتراكمة على الواجهة PRP/ربك.
-
إعداد الصفائح الدموية غسلها (اختياري)
- وتجمع أجهزة الطرد المركزي الحزب الثوري في 400 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وإبقاء الكريات الصفائح الدموية.
- بلطف تغسل الكريات بإضافة 5 مل من المخزن المؤقت لكلية الدراسات العليا (120 مم كلوريد الصوديوم، الجلوكوز 30 ملم وسترات صوديوم 12.9 مم، الرقم الهيدروجيني 6.5) وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ريسوسبيند الكريات الصفيحات مع 3 مل من تعديل تيرودي العازلة (مم كلوريد الصوديوم، مم 0.34 نة2بو4، 2.9 مم بوكل، 12 مم ناكو3، 20 مم حبيس، 1 مم مجكل2, 2 مم كاكل2، 10 مم الجلوكوز الأس الهيدروجيني 7.4 من 134).
- تمييع الصفائح الدموية (1: 100 – كمثال، 10 ميليلتر من الصفائح الدموية في ميليلتر 990 من حل ريس-إيكر) مع الحل إيكر ريس والعدد حسب هيموسيتوميتير.
- ضبط كثافة الصفائح الدموية إلى 3 × 108 خلايا/مل بإضافة تيرودي المخزن المؤقت.
- احتضان تعليق الصفائح الدموية في 37 درجة مئوية ح 1 قبل البدء في التجربة.
ملاحظة: الصفائح الدموية غسلها مستقرة ح 5 – 8 عند 37 درجة مئوية.
-
إعداد غسلها من خلايا الدم الحمراء (RBC)
- وبعد جمع والطرد المركزي بيليه الناعمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.3 في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه ربك مع 5 مل من برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة من أجل 3 مرات.
- تجاهل برنامج تلفزيوني واستخدام كرات الدم الحمراء غسلها لإجراء مزيد من التجارب.
2-ديوكسيجينيشن
- أضف 1 مل الخليط من الحزب الثوري (أعد الخطوة 1.1.4. أو 1.2.4.) وكرات الدم الحمراء (إعداد في "الخطوة 1-3".) في الهيماتوكريت المرجوة في زجاجة البولي بروبلين مغلقة بسداده مطاطية. على سبيل المثال، في الهيماتوكريت 20%، إضافة 200 ميليلتر من كرات الدم الحمراء إلى 800 ميليلتر من الحزب الثوري الشعبي.
ملاحظة: واقترح هيماتوكريتس من 0% تصل إلى 40%. لا تستخدم زجاجة زجاجية أو قارورة كما تتقيد الصفائح الدموية على سطح الزجاج. - أدخل إبرة متصلة بخزان غاز الهليوم في زجاجة مغلقة وجعل منفذ الغاز عن طريق إدخال إبرة ز 26 (الشكل 1).
- ببطء عباب الزجاجة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: لا تسمح للغاز أنه إلى فقاعة من خلال إعداد الدم. تدفق الغاز بطيئة الأفضل لهذا الإجراء، وسرعة مفرطة تدفق الغاز أنه يؤدي إلى زيادة انحلال الدم. يحتاج تدفق الغاز الأكثر كفاءة يتحدد بالمحاكمة، كما أنه يعتمد إلى حد كبير على هندسة الإعداد التجريبية. - متابعة عملية ديوكسيجينيشن دورياً بقياس ضغط الأكسجين الجزئي (ص2) استخدام التاكسج المشارك.
ملاحظة: في أيدينا، 10 دقيقة من ديوكسيجينيشن نقصان ص2 إلى 25 مم زئبق هو مطلوب للحد من النترات باستمرار ديوكسيجينيشن كرات الدم الحمراء. زيادة خفض بو2 إلى 10 مم زئبق؛ ومع ذلك، فإنه أدى إلى زيادة انحلال الدم والزيادات في الخلية الحرة الهيموغلوبين (الشكل 2).
3-خلايا الدم الحمراء نتريت الحد
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) إلى مجموعة 0.0345 نانو2 لجعل الحل الأسهم 500 مم من النترات. تمييع مم 500 نانو2 إلى 250 ميكرومتر نانو2 (25 س) بتمييع المسلسل في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
- استخدام ميكروسيرينجي، حقن النتريت (40 ميكروليتر) عبر الحاجز في العينة deoxygenated الحزب الثوري وكرات الدم الحمراء لتحقيق تركيزات نهائية من 10 ميكرون في المجموع 1 مل من عينة.
ملاحظة: في هذه التجربة، هو نهائي تركيزات النترات المستخدمة 10 ميكرون. - احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو أطول.
ملاحظة: ضبط مدة الحضانة ربك الدقيق مع النيتريت اللازمة لتخفيض نتريت القصوى لنوع مختلف من التجارب. - إزالة سداده وماصة 1 مل العينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- "الماصة؛" ميليلتر 300 تعليق الصفائح الدموية من الجزء العلوي من المادة طافية وخلط مع حوار التعاون الآسيوي (الرقم الهيدروجيني 6.5) بنسبة 1:9. تجاهل بيليه ربك.
- الطرد المركزي بتعليق الصفائح الدموية في 500 x ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة ميليلتر 80 من تحلل المثلج المخزن المؤقت (150 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم تريس، 0.5% NP-40، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على مثبطات البروتياز الكريات ثالثا كوكتيل (1: 500) إلى الصفائح الدموية.
4-غرب النشاف من بسب
- تحميل 15 ميكروغرام من البروتين من كل عينة إلى 10% منفصلة 2 الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية.
ملاحظة: المخزن المؤقت تجريد القاسية، التي تحتوي على ب-mercaptoethanol، يتعذر إزالة الأجسام المضادة فاسب فSer239 وفاسب من الغشاء؛ ولذلك، فبسب Ser239 وبسب يجب تشغيل بشكل منفصل. - تشغيل المواد الهلامية في 120 V 1.30 ح ونقل للغشاء النيتروسليلوز.
- كتلة غير محددة ملزمة مع اللبن المجفف الخالي من الدسم 5%.
- احتضان الغشاء مع فبسبSer239 (1: 500)، بسب (1:1، 000) وجابده (1:1، 000) للمبيت في 4 درجات مئوية.
- احتضان الفجل البيروكسيديز (HRP) الجسم المضاد الثانوي مع الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كشف الغشاء مع جهاز تصوير وقياس كثافة الفرقة باستخدام إيماجيج.
النتائج
عينات الدم الوريدي يكون بو2 القيم بين 50-80 مم زئبق. ديوكسيجينيشن بالهيليوم يقلل من سرعة بو2 إلى 25 مم زئبق داخل 10 دقيقة زيادة ديوكسيجينيشن مرة أخرى قليلاً النقصان بو2. ومع ذلك، زيادة الوقت من ديوكسيجينيشن يؤدي أيضا إلى ارتفاع كبير في مستويات الهيموغلوبين ال...
Discussion
حيث يتم تنشيط الصفائح الدموية بسهولة، لطيف معالجة الصفائح الدموية التي تحتوي على عينات مطلوب. وينبغي تجنب بيبيتينج سريعة وقوية تهتز. يمكن استخدام مثبطات الصفائح الدموية مثل بروستاسيكلين (PGI2) لمنع تنشيط الصفائح الدموية؛ ومع ذلك، قد يؤثر هذا على بعض مسارات الإشارات داخل الصفائح الدم?...
Disclosures
يتم سرد الدكتور ألن شيشتر اعتباره مخترع المشارك على العديد من براءات الاختراع الصادرة إلى "المعاهد الوطنية للصحة" لاستخدام أملاح النترات لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية. ويتلقى الإتاوات استناداً إلى المعاهد الوطنية للصحة الترخيص لبراءات الاختراع للتطوير السريري ولكن لا تعويضات أخرى.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بمنحه داخلية المعاهد الوطنية للصحة للدكتور ألن أ. شيشتر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2-; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved