Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per affrontare l'uso potenziale delle piastrine come un sensore molto sensibile dell'ossido di azoto nel sangue. Esso descrive la preparazione iniziale della piastrina e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate come generatori di ossido nitrico.

Abstract

Le piastrine sono le componenti del sangue responsabili della coagulazione sanguigna corretta. Loro funzione altamente è regolata da varie vie. Uno dei più potenti agenti vasoattivi, ossido nitrico (NO), può anche agire come un potente inibitore dell'aggregazione piastrinica. Diretto nessun rilevamento nel sangue è molto impegnativo a causa della sua alta reattività con emoglobina senza cellula che non limita Half-Life per la gamma di millisecondo. Attualmente, nessun cambiamento dopo gli interventi sono solo stimati basato sui cambiamenti misurati di nitriti e nitrati (membri del pathway metabolici di nitrato-nitrito-NO). Tuttavia precisa, queste misure sono piuttosto difficili da non interpretare vis à vis effettivo modifiche, a causa del nitrito naturalmente elevato della linea di base e livelli che sono diversi ordini di grandezza superiori a cambiamenti attesi non sé di nitrati. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi diretti e semplici che permetterebbero di individuare direttamente NO è attesa da tempo. Questo protocollo non risolve un potenziale impiego delle piastrine come un altamente sensibili sensore nel sangue. Descrive come nessun generatori di plasma ricco di piastrine iniziale (PRP) e delle piastrine lavate i preparativi e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate. Fosforilazione della VASP a serina 239 (P-VASP^Ser239) viene utilizzata per rilevare la presenza di NO. Il fatto che la proteina VASP è altamente espressa in piastrine e che esso viene rapidamente fosforilata quando nessuno è presente conduce a un'occasione unica per utilizzare questa via per non rilevare direttamente la presenza nel sangue.

Introduzione

Le piastrine sono piccole cellule a forma di disco frammenti derivate dai megacariociti che sono fondamentali per la coagulazione del sangue. La cascata di coagulazione è iniziata da varie molecole bioattive (come collagene o ADP), pubblicati dopo la ferita della parete vascolare. Processo di coagulazione del sangue può essere modificato, tra vari effettori dall'ossido nitrico (NO). NO, prodotta naturalmente dalle cellule di mammiferi, è uno dei più versatili segnali fisiologici. Esso agisce come un potente vasodilatatore, neurotrasmettitore e modulatore immunitario, per citarne alcune delle sue numerose funzioni. Nel sangue, NO anche aiuta a regolare l'entità della coagulazione del sangue inibendo l'aggregazione della piastrina. Una delle fonti più probabile di NO nel sangue è nitrito, un ione inorganico che ha dimostrato di servire come un precursore del No. Reagendo con globuli rossi (RBCs), nitrito è ridotto a n e deoxyHb è ossidato a metaemoglobina (metHb)¹. NO rilasciato da globuli rossi è vasoattivi e provoca vasodilatazione². Questo percorso di riduzione di nitriti non è un supplente nessun percorso di generazione, agire insieme con e non integrare la classica nessun percorso di generazione mediante endoteliale di ossido nitrico sintasi in condizioni di ipossia.

Le piastrine se stessi non sono in grado di ridurre il nitrito in NO ma sono molto sensibili alla sua presenza. In piastrine intatte, non nel nanomolari gamma aumenta cGMP (CE₅₀ = 10 nM) e fosforilazione della VASP (CE₅₀ = 0.5 nM)³. Di conseguenza, le piastrine possono servire come un ottimo sensore di riduzione di nitrito di RBCs e nessun rilascio nel sangue. Ci sono diversi metodi che possono misurare direttamente il grado di attivazione piastrinica - come aggregometria e tromboelastografia (TEG)^4,5. Tuttavia, questi metodi richiedono strumentazione specializzata costosi e piuttosto grandi quantità di materiale. È inoltre possibile monitorare gli eventi a valle, dopo NO viene rilasciato da globuli rossi, utilizzando i cambiamenti nell'espressione di proteina di superficie delle piastrine – ad esempio P-selectin⁶. NON è noto anche per aumentare la quantità di cGMP in piastrine⁷. In precedenza, abbiamo usato cGMP per non controllare nessun rilascio nel sangue dopo la riduzione del nitrito di deossigenata RBC⁸. Ciò rivelata per essere un metodo molto sensibile; Tuttavia, cGMP è una molecola di breve durata e la relativa rilevazione coinvolge vasto lavoro. Un'altra possibilità, descritta nel protocollo presentato, utilizza la fosforilazione del phospho vasodilatatore-stimolata (VASP)-proteina per rilevare la presenza di NO nel sangue. VASP è un substrato di attivazione della proteina chinasi G, che è fosforilata sull'interazione con NO attraverso la via sGC/cGMP⁹. Fosforilazione VASP rilevabile si verifica molto basso senza concentrazioni, che potrebbero rendere le piastrine un rivelatore molto sensibile di nessuna presenza nel sangue. VASP è altamente espresso in piastrine, ma non in altre cellule del sangue, che permette di seguire in modo selettivo gli eventi che coinvolgono le piastrine¹⁰.

L'obiettivo principale del presente protocollo è di descrivere il metodo in dettaglio per la rilevazione di nessun rilascio nel sangue intero utilizzando la sua interazione con le piastrine monitorando VASP fosforilazione^11,12. Il metodo descritto non consente di individuazione tempestiva di basso vi erano concentrazioni - teoricamente in gamma nanomolar che rende più sensibile di determinazione di cGMP, dovute all'uso di tecniche standard Western blot realizzabili in laboratorio la maggior parte del presente protocollo Impostazioni.

Protocollo

Nota: I campioni di sangue sono stati ottenuti dalla banca del sangue di NIH (IRB approvato protocollo: 99-CC-0168).

1. sangue preparazione del campione

Nota: Per evitare l'attivazione della piastrina, prelievo di sangue lentamente e mescolare delicatamente con citrato capovolgendo la provetta diverse volte.

1. Preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP)
   1. 30 – 50 mL di sangue utilizzando un 20 G o un ago di diametro più grande di disegnare e aggiungere in una provetta contenente citrato di sodio (3.8%) in un rapporto di 1:9 o acido citrato destrosio (ACD) (citrato trisodico 85mm, acido citrico 66,6 mM, 111 millimetri di glucosio, pH 4.5) in un rapporto di 1:6.
   2. Aliquotare 5 mL di sangue intero appena raccolti in provette coniche da 15 mL vuote. Centrifugare il sangue intero a 120 x g per 10 min a temperatura ambiente.
   3. Raccogliere con cura il supernatante contenente le piastrine (plasma ricco di piastrine, PRP) dalla parte superiore mediante una pipetta di trasferimento in plastica.
      Nota: PRP dal punto 1.1.3 è pronto per l'uso negli esperimenti o per un'ulteriore elaborazione per preparare lavato le piastrine. Il morbido pellet ottenuto dopo centrifugazione (punto 1.1.2) contiene globuli rossi e globuli bianchi e può essere ulteriormente purificato per ottenere lavati globuli rossi (RBC) — vedere passaggio 1.3. L'esperimento deve essere finito entro 2 h dopo il prelievo di sangue. Quando si raccolgono PRP (surnatante), evitare la raccolta di buffy coat-contenenti leucociti accumulato nell'interfaccia di PRP/RBC.
2. Preparazione delle piastrine lavate (opzionale)
   1. Centrifuga raccolti PRP a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e mantenere i pellet della piastrina.
   2. Lavare delicatamente i pellet aggiungendo 5 mL di tampone CGS (120 mM NaCl, 12,9 millimetri trisodio citrato e 30 mM di glucosio, pH 6,5) e centrifuga a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente.
   3. Risospendere il pellet della piastrina con 3 mL di buffer di Tyrode modificato (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2,9 mM KCl, 12mm NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2mm CaCl₂, 10 mM a pH 7,4 glucosio).
   4. Diluire le piastrine (1: 100 — come esempio, 10 µ l di piastrine nel 990 µ l di soluzione di Rees-Ecker) con soluzione di Rees Ecker e conteggio di un emocitometro.
   5. Regolare la densità delle piastrine a 3 x 10⁸ cellule/mL aggiungendo Tyrode buffer.
   6. Incubare la sospensione della piastrina a 37 ° C per 1 h prima di iniziare l'esperimento.
      Nota: Piastrine lavate sono stabili per 5 – 8 h a 37 ° C.
3. Preparazione della lavata di globuli rossi (RBC)
   1. Dopo la raccolta, centrifugare il pellet morbido ottenuto nel passaggio da 1.1.3 a 2.500 x g per 10 min a temperatura ambiente.
   2. Scartare il surnatante e lavare la pallina di RBC con 5 mL di PBS mediante centrifugazione a 2.500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione per 3 volte.
   3. Scartare il PBS e utilizzare globuli rossi lavati per ulteriori esperimenti.

2. deossigenazione

1. Aggiungere 1 mL di una miscela di PRP (preparata al punto 1.1.4. o 1.2.4.) e globuli rossi (preparati al passaggio 1.3.) presso l'ematocrito desiderata in una bottiglia in polipropilene chiusa con un tappo di gomma. Ad esempio, al 20% ematocrito, aggiungere 200 µ l di RBCs a 800 µ l di PRP.
   Nota: Ha suggerito gli ematocriti sono da 0% fino al 40%. Non utilizzare una bottiglia di vetro o il pallone come le piastrine aderiscono alla superficie di vetro.
2. Inserire l'ago collegato al serbatoio di elio gas in bottiglia chiusa e rendere l'uscita del gas con l'inserimento di un ago da 26 G (Figura 1).
3. Roteare lentamente la bottiglia a temperatura ambiente.
   Nota: Non consentire il gas He bolla attraverso la preparazione di sangue. Flusso di gas lento è preferibile per questa procedura ed eccessivamente veloce flusso di gas di lui conduce al hemolysis aumentato. Il flusso di gas più efficiente deve essere determinato dalla prova, come altamente dipende dalla geometria del setup sperimentale.
4. Periodicamente è possibile seguire il processo di deossigenazione misurando la pressione parziale dell'ossigeno (pO₂) utilizzando un Co-ossimetro.
   Nota: Nelle nostre mani, 10 min di deossigenazione diminuzioni pO₂ a 25 mmHg, che è necessaria per la riduzione del nitrito di RBCs. continuando la deossigenazione ridurre ulteriormente pO₂ a 10 mmHg; Tuttavia, ha condotto al hemolysis aumentato e l'aumento dell'emoglobina senza cellula (Figura 2).

3. globuli nitrito riduzione

1. Aggiungere 1 mL di PBS (pH 7.4) in 0,0345 g di NaNO₂ per rendere la soluzione di riserva di 500 mM di nitrito. Diluizione seriale in PBS (pH 7.4), diluire 500 mM NaNO₂ a 250 µM NaNO₂ (25x).
2. Utilizzando una microsiringa, iniettare nitrito (40 µ l) attraverso il setto nel campione deossigenato di PRP e globuli rossi per ottenere le concentrazioni finali di 10 µM in totale 1 mL di campione.
   Nota: In questo esperimento, le concentrazioni finali di nitrito utilizzato è di 10 µM.
3. Incubare il campione a 37 ° C per 10 minuti o più.
   Nota: Regolare l'esatta durata di incubazione di RBC con nitrito necessario per la riduzione del nitrito massima per diversi tipi di esperimenti.
4. Rimuovere il tappo e la pipetta da 1 mL del campione in una provetta da microcentrifuga.
5. Centrifugare a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente.
6. Dispensare 300 µ l della sospensione piastrinica da parte superiore del surnatante e mescolare con il ACD (pH 6,5) in un rapporto di 1:9. Scartare il pellet di RBC.
7. Centrifugare la sospensione delle piastrine a 500 x g per 4 min a temperatura ambiente.
8. Aggiungere 80 µ l di tampone di lisi ghiacciata (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7.4) contenente inibitore della proteasi cocktail III (1: 500) il recettore piastrinico pellet.

4. Western Blotting della VASP

1. Carico 15 µ g di proteina da ogni campione a 2 separati 10% gel di SDS-PAGE.
   Nota: Buffer di strippaggio duro, che contiene b-mercaptoetanolo, non è possibile rimuovere gli anticorpi P-VASP^Ser239 e VASP dalla membrana; di conseguenza, P-VASP ^Ser239 e VASP dovrebbe essere gestito separatamente.
2. Eseguire i gel 120 V per h 1,30 e trasferimento alla membrana di nitrocellulosa.
3. Legame non specifico di blocco con 5% senza grassi del latte secco.
4. Incubare la membrana con P-VASP^Ser239 (1: 500), VASP (1:1, 000) e GAPDH (1:1, 000) per una notte a 4 ° C.
5. Incubare anticorpo secondario di rafano perossidasi (HRP) con la membrana per 45 min a temperatura ambiente.
6. Esporre la membrana con una macchina di imager e quantificare la densità di banda usando ImageJ.

Risultati

I campioni di sangue venoso hanno pO₂ valori tra 50-80 mmHg. Deossigenazione di elio diminuisce velocemente pO₂ a 25 mmHg entro 10 min. Increased deossigenazione tempo leggermente maggiori diminuzioni pO₂. Tuttavia, tempo aumentato di deossigenazione inoltre conduce ai livelli significativamente aumentati di emoglobina senza cellula (determinato dal Co-ossimetro, visivamente visto in Figura 2 come colorazione sempre più rossa...

Discussione

Poiché le piastrine sono attivate, un trattamento delicato del piastrina-contenenti campioni è richiesto. Pipettaggio veloce e vigorosa agitazione dovrebbe essere evitati. Inibitori delle piastrine come prostaciclina (PGI₂) possono essere utilizzati per impedire l'attivazione della piastrina; Tuttavia, questo potrebbe influire sulla alcune vie di segnalazione all'interno delle piastrine. Per la preparazione di pellet della piastrina, aggiungiamo ACD per le sospensioni della piastrina e utilizzare centrifugaz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-sodium citrate	Supply by NIH blood bank
Citric acid	Supply by NIH blood bank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; sodium chloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; potassium chloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; sodium bicarbonate	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calcium chloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles	Nalgene	2089-0001
Red septum stopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; sodium nitrite	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody	Cell signaling technology	3114
VASP antibody	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer