板基检测血液中一氧化氮的 vasp 磷酸化

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以解决潜在的使用血小板作为一个高度敏感的一氧化氮传感器在血液中。它描述了最初的血小板制备和使用亚硝酸盐和脱氧红细胞作为一氧化氮发生器。

摘要

血小板是负责适当血液凝集的血液成分。它们的功能受到各种途径的高度调节。其中最有效的血管活性物质, 一氧化氮 (no), 也可以作为血小板聚集的强大抑制剂。血液中的直接 no 检测是非常具有挑战性的, 因为它具有高反应性与无细胞血红蛋白, 限制 no 的半衰期到毫秒的范围。目前, 干预后的 no 变化仅根据亚硝酸盐和硝酸盐 (亚硝酸盐-一氧化氮代谢途径的成员) 的测量变化进行估计。无论多么精确, 这些测量相对于实际 no 变化的情况很难解释, 因为自然基线亚硝酸盐和硝酸盐水平比 no 本身的预期变化高几个数量级。因此, 早就应该开发直接和简单的方法, 使人们能够直接检测到 no。该协议解决了血小板作为血液中高度敏感的 no 传感器的潜在用途。它描述了最初的血小板富糖血浆 (prp) 和洗血小板制剂, 以及亚硝酸盐和脱氧红细胞作为 no 发生器的使用。采用丝氨酸 239 (p-vasp^serine) 法对 vasp 进行磷酸化检测。事实上, vasp 蛋白是高度表达在血小板, 它是快速磷酸化时, no 存在导致一个独特的机会, 使用这一途径直接检测血液中的 no 存在。

引言

血小板是从巨核细胞中提取的小圆盘状细胞碎片, 对凝血至关重要。凝血级联是由各种生物活性分子 (如胶原蛋白或 adp), 释放后的血管壁损伤。一氧化氮 (no) 在各种效应之间可以改变凝血过程。no 是由哺乳动物细胞自然产生的, 是最通用的生理信号之一。它作为一个强大的血管扩张剂, 神经递质和免疫调节剂, 仅举几例。在血液中, no 还有助于通过抑制血小板聚集来调节血液凝集的程度。在血液中 no 最可能的来源之一是亚硝酸盐, 这是一种无机离子, 已被证明是 no 的前体。与红细胞反应时, 亚硝酸盐还原为 no, 脱氧 hb 氧化为高铁血红蛋白 (methb)¹。从红细胞释放的 no 是血管活性的, 并导致血管兴奋性 2。这种亚硝酸盐还原途径是一种交替的 no 生成途径, 在缺氧条件下, 通过内皮型一氧化氮合酶与经典 no 生成途径一起作用并补充该途径。

血小板本身不能将亚硝酸盐还原为 no, 但对其存在非常敏感。在完整的血小板中, 纳米摩尔范围内的 no 增加了 vasp (ec₅₀ = 0.5 nm) 3 的 cgmp (ec₅₀ = 10 nm)^和磷酸化。因此, 血小板可以作为一个很好的传感器, 亚硝酸盐还原由 rbc 和 no 释放到血液中。有几种方法可以直接测量血小板活化的程度-如聚合和血栓弹性成像 (teg)^4,5。然而, 这些方法需要昂贵的专门仪器和相当大量的材料。在从 rbc 释放 no 后, 也可以利用血小板表面蛋白表达的变化--如 p-选择素 6--来监测下游的事件.no 也被认为会增加血小板7中的 cgmp 量。以前, 我们使用 cgmp^监测脱氧红细胞8还原亚硝酸盐后一氧化氮释放到血液中。这被证明是一个非常敏感的方法;然而, cgmp 是一种短命的分子, 它的检测涉及大量的劳动。另一种可能性, 在提交的协议中描述, 使用磷酸化的血管刺激荧光粉 (vasp)-蛋白检测 no 在血液中的存在。vasp 是蛋白激酶 g 活化的基础, 通过 sgccgmp 途径⁹与 no 相互作用时进行磷酸化。可检测的 vasp 磷酸化发生在非常低的 no 浓度下, 这可能使血小板成为血液中 no 存在的非常敏感的检测器。vasp 在血小板中表达很高, 但在其他血细胞中没有, 这使得有选择地跟踪涉及血小板¹⁰的事件。

该方案的主要目的是通过监测 vasp 磷酸化^11,12, 详细描述利用其与血小板的相互作用检测全血一氧化氮释放的方法。该方法允许早期检测低 no 浓度-理论上在纳米摩尔范围内, 这使得目前的协议比 cgmp 的测定更敏感, 因为使用的标准西方印迹技术可以在大多数实验室实现设置。

研究方案

请注意:血液样本来自国家卫生研究院血库 (irb 批准的协议:99-cc-0168)。

1. 血液样品制备

请注意:为了避免血小板活化, 慢慢抽血, 并通过多次倒置管与柠檬酸盐轻轻混合。

1. 富含血小板的血浆 (prp) 制备
   1. 用 20 g 或更大直径的针头绘制30-50 毫升的血液, 并以1:9 的比例或柠檬酸葡萄糖 (acd) (85 mm 柠檬酸三钠) 加入含有柠檬酸钠 (3.8%) 的试管中, 66.6 mm 柠檬酸, 111 mm 葡萄糖, ph 4.5), 比例为1:9。
   2. 将新鲜采集的全血液注入空的15毫升锥形管中。在室温下以 120 x g 离心全血10分钟。
   3. 用塑料转移移液器从上半部分仔细收集含有血小板 (富含血小板的血浆, prp) 的上清液。
      请注意:prp 从步骤1.1.3 准备用于实验或进一步处理, 以准备清洗的血小板。离心后获得的软颗粒 (步骤 1.1.2) 含有红血球和白细胞, 可以进一步纯化以获得清洗的红血球 (rbc)--请参见步骤 1.3.实验需要在抽血后2小时内完成。在收集 prp (上清液) 时, 避免收集在 prp/rbc 界面上积累的含有脂肪的白细胞。
2. 洗过的血小板制备 (可选)
   1. 离心机在室温下以 400 x g收集 prp 10分钟。丢弃上清液并保留血小板颗粒。
   2. 在室温下加入5毫升 cgs 缓冲液 (120 mm 氯化钠、12.9 mm 柠檬酸三钠和 30 mL 葡萄糖, ph 6.5) 和离心机 10分钟, 轻轻清洗颗粒.
   3. 用3毫升改性的 ty伴随下缓冲液 (134 mm ncl, 0.34 mm nah 2 po₄, 2.9 mm kcl, 12 mm nhaco₃, 20 mm hepes, 1 mm mgcl₂, 2 mm cicl₂, 10 mm 葡萄糖 ph 7.4)。
   4. 用 rees ecker 溶液稀释血小板 (1:100--例如, 在990μl 的 rees-ecker 溶液中稀释10μl 的血小板), 并通过血细胞计进行计数。
   5. 通过添加 tyrode 缓冲液, 将血小板密度调整为 3 x¹⁰ 8 cellslss/ml。
   6. 在开始实验前, 在37°c 下将血小板悬浮液培养1小时。
      请注意:在37°c 下, 洗过的血小板稳定5-8小时。
3. 洗红血球 (rbc) 的制备
   1. 收集后, 离心机在步进中获得的软颗粒1.1.3 在 2, 500 x克, 在室温下10分钟。
   2. 在室温下以 2, 500 x 克离心 10分钟, 用5毫升的 pbs 离心, 将上清液丢弃, 用5毫升的 pbs 清洗 rbc 颗粒。重复此步骤3次。
   3. 放弃 pbs, 使用清洗的 rbc 进行进一步的实验。

2. 脱氧

1. 在所需的红细胞压积中加入1毫升的 prp 混合物 (在步骤1.1.4 或1.2.4 中制备) 和 rbc (在步骤1.3 中制备), 加入用橡胶塞子关闭的聚丙烯瓶。例如, 在20% 的红细胞压积时, 将200μl 的红细胞添加到800μl 的 prp 中。
   请注意:建议的血肿是从0% 到40%。不要使用玻璃瓶或烧瓶, 因为血小板粘附在玻璃表面。
2. 将连接到氦气罐的针头插入密闭的瓶子, 通过插入 26 g 针使气体出口成为气体出口 (图 1)。
3. 在室温下慢慢地旋转瓶子。
   请注意:不要让他的气体通过血液准备泡沫。慢速气流是可取的这个做法, 和过快他的气体流动导致增加溶血。最有效的气体流动需要通过试验来确定, 因为它在很大程度上取决于实验装置的几何形状。
4. 通过使用 co-oxyneter 测量部分氧气压力 (po2),定期遵循脱氧过程。
   请注意:在我们手中, 10分钟的脱氧可将 rbc 还原亚硝酸盐所需的 po 2 至25毫米汞柱降低, 持续的脱氧确实进一步降低了 po₂至10毫米汞柱;然而, 它导致了溶血的增加和无细胞血红蛋白的增加 (图 2)。

3. 减少红血球亚硝酸盐

1. 在0.0345 克的 nno 2 中加入1毫升的 pbs (ph 7.4 ), 制成 500 mm 的亚硝酸盐库存溶液。在 pbs 中连续稀释 500 mm nno 2 至 250μm nno 2 (25x)₍ ph 7.4)。
2. 使用微注射器, 通过隔膜将亚硝酸盐 (40μl) 注入 prp 和 rbc 的脱氧样品中, 以在样本的总1毫升中达到10μm 的最终浓度。
   请注意:在本实验中, 使用的亚硝酸盐的最终浓度为10μm。
3. 在37°c 下将样品孵化10分钟或更长时间。
   请注意:在不同类型的实验中, 用亚硝酸盐最大还原亚硝酸盐所需的亚硝酸盐调整红细胞培养的确切持续时间。
4. 将样品的塞子和移液器1毫升取出到微离心管中。
5. 在室温下以 200 x g 离心3分钟。
6. 从上清液的上半部分移液器300μl 的血小板悬浮液, 并与 acd (ph 6.5) 混合, 比例为1:9。丢弃 rbc 颗粒。
7. 在室温下以 500 x g 离心血小板悬浮液4分钟。
8. 加入含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒 iii (1:500) 的冰冷裂解缓冲液 (150 mm ncl, 50 mm tris, 0.5% np-40, ph 7.4) 80μl。

4. 西部空白的 vasp

1. 从每个样品中装入15μg 的蛋白质, 使其达到2个分离的 10% sds-page 凝胶。
   请注意:含有 b-硫醇的苛刻剥离缓冲液不能从膜中去除 p-vasp^ser239和 vasp 抗体;因此, p-vasp ^ser239和 vasp 应单独运行。
2. 在 120 v 的速度运行凝胶1.30 小时, 并转移到硝化纤维素膜。
3. 块非特异性与5% 无脂干奶结合。
4. 用 p-vasp^血清239 (1:500)、vasp (1:1000) 和 gapdh (1:1000) 在4°c 下隔夜培育膜。
5. 在室温下将辣根过氧化物酶 (hrp) 二级抗体与膜培养45分钟。
6. 用成像仪机公开膜, 并使用 imagej 量化带密度。

结果

静脉血液样本的 no-₂值在50-80 毫米汞柱之间。氦的脱氧在10分钟内迅速降低到 2 , 2到25毫米汞柱. 脱氧时间的增加会进一步进一步降低到 o₂。然而, 脱氧时间的增加也会导致无细胞血红蛋白水平的显著增加 (由 co-oxometer 确定, 在图 2中可以看到血浆的颜色越来越变红) (图 2a-b)。增加溶血与搅拌无...

讨论

由于血小板很容易被激活, 因此需要温和地处理含有血小板的样品。应避免快速移液和剧烈晃动。血小板抑制剂如前列腺素 (pgi₂) 可用于防止血小板活化;然而, 这可能会影响血小板内的一些信号通路。在血小板悬浮液中加入 acd, 采用低速离心法制备血小板颗粒。

prp 中新鲜配制的血小板的寿命有限, 最长可达2小时。为了实现高重现性, 所有实验应只在新鲜血小板和血液?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-sodium citrate	Supply by NIH blood bank
Citric acid	Supply by NIH blood bank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; sodium chloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; potassium chloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; sodium bicarbonate	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calcium chloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles	Nalgene	2089-0001
Red septum stopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; sodium nitrite	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody	Cell signaling technology	3114
VASP antibody	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer