АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для удовлетворения потенциального использования тромбоцитов как датчик высокочувствительный оксида азота в крови. Он описывает подготовку первоначальных тромбоцитов и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как оксид азота генераторов.

Аннотация

Тромбоциты являются крови компонентов, отвечающих за надлежащее крови свертываясь. Их функция высоко регулируется различными путями. Один из самых мощных вазоактивных агентов, оксид азота (NO), также могут служить мощным ингибитором агрегации тромбоцитов. Прямые без обнаружения в крови является весьма сложной задачей из-за его высокую реакционную способность с свободной ячейки гемоглобина, который ограничивает не half-life в ряд миллисекунды. В настоящее время никаких изменений после вмешательства только оцениваются на основе измеренных изменений нитритов и нитратов (члены метаболический путь Нитрат нитрит нет). Однако, эти измерения точны достаточно сложно интерпретировать визави фактической никаких изменений, благодаря естественно высокий базовый нитритов и нитратов уровней, которые являются несколько порядков выше, чем ожидаемые изменения не сама по себе. Таким образом развитие прямых и простые методы, позволяющие определять NO непосредственно назрела давно. Этот протокол рассматриваются возможности использования тромбоцитов как высокочувствительный не датчик в крови. Он описывает первоначальный тромбоцитов богатой плазмы (PRP) и промывают тромбоцитов подготовка и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как нет генераторов. Фосфорилирование VASP на Серин 239 (Ser239P-VASP) используется для обнаружения присутствия № Тот факт, что белок VASP высоко выражается в тромбоцитах и что он быстро фосфорилированных когда NO присутствует приводит к уникальную возможность использовать этот путь непосредственно не обнаружение в крови.

Введение

Тромбоциты являются фрагменты небольшие дискообразный клеток, производный от megakaryocytes, которые имеют решающее значение для свертывания крови. Каскад свертывания инициируется различных биоактивных молекул (например, коллаген или ADP), выпущенные после повреждения сосудистой стенки. Процесс свертывания крови могут быть изменены, среди различных эффекторов, оксида азота (NO). НЕТ, естественным образом вырабатывается клетками млекопитающих, является одним из самых разносторонних физиологических сигналов. Он действует как мощным сосудорасширяющим, нейромедиаторов и иммунного модулятора, чтобы назвать несколько из его многочисленных функций. В кровь нет также помогает регулировать степень свертывания крови, препятствует агрегации тромбоцитов. Одним из наиболее вероятные источники NO в крови является нитрит, неорганических ионов, что было показано, чтобы служить в качестве прекурсора № Реагирующих с красных кровяных телец (эритроцитов), нитрит сводится к NO и deoxyHb окисляется до метгемоглобина (metHb)1. НЕТ, освобождены от RBCs вазоактивное и вызывает покровов2. Этот путь сокращения нитрит-альтернативный путь не поколения, действуя вместе с и дополнения классической путь не поколения синтаза эндотелиального оксида азота в гипоксических условиях.

Тромбоциты, сами не способны уменьшить нитритов в NO, но очень чувствительны к ее присутствию. В нетронутыми тромбоцитов, не в наномолярных диапазона увеличивает cGMP (EC50 = 10 Нм) и фосфорилирование VASP (EC50 = 0,5 Нм)3. Таким образом тромбоцитов может служить отличным датчик нитрита сокращения эритроцитов и не выброса в кровь. Существует несколько методов, которые могут непосредственно измерить степень активации тромбоцитов - как aggregometry и тромбоэластография (ГТЭ)4,5. Однако эти методы требуют дорогих специализированных приборов и довольно большое количество материала. Это также возможно для мониторинга событий вниз по течению, после не освобождается от RBCs, используя изменения экспрессии белка поверхности тромбоцитов – например P селектина6. НЕТ также известен для увеличения количества cGMP в тромбоцитов7. Ранее мы использовали cGMP для мониторинга без выброса в кровь после сокращения нитрита венозная РБК8. Это оказалось очень чувствительным методом; Однако цГМФ является молекула недолго и его обнаружение включает в себя обширные труда. Другая возможность, описано в протоколе представленных использует фосфорилирование сосудорасширяющим стимулирует фосфористой (VASP)-белок для обнаружения присутствия No в крови. VASP является субстрат протеин киназы протеина G активации, который фосфорилированных после взаимодействия с NO через sGC/cGMP путь9. Обнаружению VASP фосфорилирования происходит без каких-либо очень низкой концентрации, которые могут сделать очень чувствительной детектор не присутствие тромбоцитов в крови. VASP высоко выражается в тромбоцитах, но не в других клеток крови, который позволяет выборочно следить за событиями, с участием тромбоциты10.

Основная цель настоящего Протокола заключается в описания метод детально для обнаружения не выпуска в цельной крови, с помощью его взаимодействия с тромбоцитов, мониторинг VASP фосфорилирование11,12. Описан метод позволяет раннего обнаружения низкого не концентрации - теоретически в наномолярных диапазоне, что делает настоящий протокол более чувствительны, чем определение цГМФ за счет использования стандартной западной помарки методы достижимыми в большинстве лаборатории Параметры.

протокол

Примечание: Образцы крови были получены из низ крови банка (СИБ утвердил протокол: 99-CC-0168).

1. кровь пробоподготовки

Примечание: Чтобы избежать активации тромбоцитов, нарисовать кровь медленно и осторожно перемешать с цитрат, инвертирование трубке несколько раз.

  1. Подготовка тромбоцитов богатые плазмы (PRP)
    1. Нарисуйте 30 – 50 мл крови с помощью 20 G или большего диаметра иглы и добавить в пробирку, содержащую цитрат натрия (3,8%) в соотношении 1:9 или кислоты цитрат декстрозы (ДСА) (85 мм тринатрия цитрат, 66,6 мм лимонной кислоты, 111 мм глюкозы, pH 4.5) в соотношении 1:6.
    2. Аликвота 5 мл свеже собранных цельной крови в пустой 15 мл конические трубы. Центрифуга цельной крови на 120 x g 10 мин при комнатной температуре.
    3. Тщательно Соберите супернатанта, содержащий тромбоцитов (тромбоцитов богатые плазмы, ОТР) от верхней части пипетки пластиковые передачи.
      Примечание: PRP от шага 1.1.3 готова к использованию в экспериментах или для дальнейшей обработки подготовить промывают тромбоцитов. Мягкие лепешки, полученные после центрифугирования (шаг 1.1.2) содержит красные кровяные клетки и лейкоциты и может быть далее очищенный для получения отмытых эритроцитов (РБК) — см. шаг 1.3. Эксперимент должен быть завершена в течение 2 ч после нанесения крови. При сборе ОТР (супернатант), Избегайте коллекции Баффи пальто содержащих лейкоцитов, накопленных на интерфейсе ОТР/РБК.
  2. Подготовка промывают тромбоцитов (опционально)
    1. Центрифуга собранные PRP на 400 x g 10 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и держать гранулы тромбоцитов.
    2. Осторожно промойте гранулы, добавив 5 мл CGS буфера (120 мм NaCl, 12,9 мм тринатрия цитрат и 30 мм глюкозы, рН 6,5) и центрифуги на 400 x g 10 мин при комнатной температуре.
    3. Ресуспензируйте гранулы тромбоцитов с 3 мл модифицированных Tyrode буфера (134 мм NaCl, 0,34 мм NaH2PO4, 2.9 KCl, 12 мм NaHCO3, 20 HEPES, 2 мм CaCl2, 10 мм глюкозы рН 7,4 мм MgCl2, 1).
    4. Разбавить тромбоцитов (1: 100 — как пример, 10 мкл тромбоцитов в 990 мкл раствора Риз-Экер) с раствором Rees Экер и подсчета Горяева.
    5. Отрегулируйте плотность тромбоцитов до 3 x 108 кл/мл, добавив Tyrode буфера.
    6. Инкубируйте подвеска тромбоцитов при 37 ° C за 1 ч до начала эксперимента.
      Примечание: Промывают тромбоцитов стабильны для 5 – 8 ч при 37 ° C.
  3. Подготовка отмытых эритроцитов (РБК)
    1. После сбора центрифуга мягкие лепешки, полученного на шаге 1.1.3 в 2500 x g 10 мин при комнатной температуре.
    2. Отменить супернатант и помыть лепешка РБК с 5 мл PBS центрифугированием на 2500 x g 10 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг для 3 раза.
    3. Отменить PBS и использовать отмытых эритроцитов для дальнейших экспериментов.

2. обескислороживания

  1. Добавить 1 мл смеси ОТР (подготовлен на шаге 1.1.4. или 1.2.4.) и эритроцитов (подготовлен в шаге 1.3.) в желаемой гематокрит в бутылку полипропилен, закрыт с резиновой пробкой. Например на 20% уровень гематокрита, добавьте 200 мкл RBCs 800 мкл ОТР.
    Примечание: Предлагаемые hematocrits от 0% до 40%. Не использовать стеклянные бутылки или настой как тромбоциты придерживаться поверхности стекла.
  2. Вставьте иглу, подключенных к бак газа гелия в закрытой бутылке и сделать выход газа, вставляя иглу 26 G (рис. 1).
  3. Медленно вихрем бутылку при комнатной температуре.
    Примечание: Не позволяют он газа пузырь через кровь подготовки. Медленно газового потока является предпочтительным для выполнения этой процедуры, и чрезмерно быстрый поток газа он приводит к увеличению гемолиза. Наиболее эффективный поток газа необходимо быть определены судом, как это сильно зависит от геометрии экспериментальной установки.
  4. Периодически следить за процессом обескислороживания, измеряя парциальное давление кислорода (по2) с помощью со-оксиметра.
    Примечание: В наших руках 10 мин обескислороживания уменьшается Ро2 в 25 мм рт.ст, который необходим для сокращения нитрита RBCs. Продолжая обескислороживания дальнейшему сокращению Ро2 в 10 мм ртутного столба; Однако это привело к увеличению гемолиза и увеличение клеток свободный гемоглобин (рис. 2).

3. красных кровяных клеток нитрита сокращение

  1. Добавьте 1 mL PBS (рН 7,4) в 0.0345 g NaNO2 сделать 500 мм раствор нитрита. Разбавьте 500 мм NaNO2 250 мкм NaNO2 (25 x) путем последовательного растворения в PBS (рН 7,4).
  2. С помощью microsyringe, inject нитритов (40 мкл) через перегородки в образце венозная PRP и БС для достижения окончательного концентрации 10 мкм в целом 1 мл образца.
    Примечание: В этом эксперименте окончательный концентрации нитрита используется — 10 мкм.
  3. Инкубируйте образца при 37 ° C в течение 10 минут или дольше.
    Примечание: Отрегулируйте точную продолжительность РБК инкубации с нитрит, необходимых для сокращения максимальной нитриты для различных типов экспериментов.
  4. Удалите пробку и Пипетка 1 мл образца в пробки microcentrifuge.
  5. Центрифуга на 200 x g 3 мин при комнатной температуре.
  6. Пипетка 300 мкл тромбоцитов подвески от верхней части супернатант и смешать с ACD (рН 6,5) в соотношении 1:9. Отказаться от РБК Пелле.
  7. Центрифуга тромбоцитов подвеска на 500 x g 4 мин при комнатной температуре.
  8. 80 мкл буфера lysis ледяной (150 мм NaCl, 50 мм трис, 0,5% NP-40, рН 7,4) содержащий ингибитор протеазы гранулы коктейль III (1: 500) тромбоцитов.

4. западный Blotting VASP

  1. Загрузите 15 мкг белка из каждого образца 2 отдельных гелях SDS-PAGE 10%.
    Примечание: Суровые зачистки буфер, который содержит b меркаптоэтанол, нельзя удалить P-VASPSer239 и VASP антитела от мембраны; Таким образом P-VASP Ser239 и VASP следует запускать отдельно.
  2. Запустите гели на 120 V 1.30 ч и передачи на нитроцеллюлозную мембрану.
  3. Блок-неспецифический привязка с 5% обезжиренное сухое молоко.
  4. Проинкубируйте мембрану с P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) и GAPDH (1:1, 000) на ночь при 4 ° C.
  5. Инкубируйте хрен пероксидазы (ПХ) вторичные антитела с мембраной для 45 мин при комнатной температуре.
  6. Разоблачить мембраны с машиной тепловизор и количественно определить плотность группы с помощью ImageJ.

Результаты

Пробы венозной крови имеют Ро2 значения между 50-80 мм рт.ст.. Обескислороживания, гелий быстро уменьшается Ро2 в 25 мм рт.ст, в течение 10 мин увеличение обескислороживания время чуть дальше уменьшается по2. Однако, увеличение времени обескислороживания та...

Обсуждение

Так как тромбоциты активируются легко, щадящая обработка тромбоцитов, содержащего образцы не требуется. Следует избегать быстро закупорить и энергичные встряхивания. Тромбоцитов ингибиторы, такие как простациклин (PGI2) может использоваться для предотвращения активации тромбоци...

Раскрытие информации

Д-р Алан Schechter указан как соизобретателем на несколько патентов, выданных в национальных институтов здравоохранения для использования Нитриты соли для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он получает роялти, основанные на низ лицензирования этих патентов для развития клинической, но не другие компенсации.

Благодарности

Эта работа финансировалась интрамуральных гранта NIH д-р Алан н. Шехтер.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Tri-sodium citrateSupply by NIH blood bank
Citric acidSupply by NIH blood bank
GlucoseSigmaG7528-250G
NaCl; sodium chlorideSigmaS-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrateMallinckrodt Chemical7892-04
KCl; potassium chlorideMallinckrodt Chemical6858
NaHCO3; sodium bicarbonateMallinckrodt Chemical7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]SigmaH3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chlorideQuality Biology351-033-721
CaCl2; calcium chlorideSigmaC5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottlesNalgene2089-0001
Red septum stopper NO.29FisherbrandFB57877
NaNO2-; sodium nitriteSigmaS2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethaneSigmaT8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycolSigma74385-1L
Protease inhibitor cocktail set IIICalbiochem539134
Phospho-VASP (Ser239) antibodyCell signaling technology3114
VASP antibodyCell signaling technology3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell signaling technology2118
2-mercaptoethanolSigmaM-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Laboratories111-035-003
Clarity Western ECL SubstrateBIO-RAD1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)Radiometer

Ссылки

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143deoxyhemoglobinVASP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены