Detecção baseada em plaquetas de óxido nítrico no sangue, medindo-se a fosforilação VASP

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para abordar o potencial uso de plaquetas como um sensor altamente sensível de óxido nítrico no sangue. Ele descreve a preparação inicial de plaquetas e o uso de nitrito e células vermelhas do sangue pobre em oxigênio como geradores de óxido nítrico.

Resumo

As plaquetas são os componentes do sangue responsáveis pela coagulação do sangue. Sua função é altamente regulada por vários caminhos. Um dos mais potentes agentes vasoativas, óxido nítrico (NO), também pode atuar como um potente inibidor da agregação plaquetária. Direto não detecção no sangue é muito desafiador devido à sua alta reatividade com hemoglobina livre celular que não limita nenhum Half-Life para o intervalo em milissegundos. Atualmente, nenhuma alteração após intervenções são apenas estimadas baseado no medido mudanças de nitritos e nitratos (membros da via metabólica de nitrato-nitrito-não). No entanto preciso, as medidas são um pouco difícil de interpretar vis a vis um real sem alterações, devido a nitrito de base naturalmente elevada e nitrato de níveis que são várias ordens de magnitude maior do que esperado mudanças sem si. Portanto, o desenvolvimento de métodos simples e diretos que permita um para detectar não diretamente está muito atrasado. Este protocolo aborda um potencial uso de plaquetas como um altamente sensível sem sensor no sangue. Como não geradores descreve plasma rico de inicial de plaquetas (PRP) e preparações de plaquetas lavadas e o uso de nitrito e células vermelhas do sangue pobre em oxigênio. Fosforilação da VASP em serina 239 (P-VASP^Ser239) é usada para detectar a presença de n º. O fato de que a proteína da VASP é altamente expresso em plaquetas e que é rapidamente fosforilada quando não está presente leva a uma oportunidade única de usar esta via para detectar diretamente sem a presença de sangue.

Introdução

As plaquetas são fragmentos de células pequenas em forma de disco, derivados de megacariócitos que são cruciais para a coagulação do sangue. A cascata de coagulação é iniciada por várias moléculas bioativas (como colágeno ou ADP), lançadas após a lesão da parede vascular. O processo de coagulação do sangue pode ser modificado, entre vários efetores pelo óxido nítrico (NO). Não, naturalmente produzido por células de mamíferos, é um dos mais versáteis sinais fisiológicos. Ele age como um potente vasodilatador e neurotransmissor modulador imune, para citar algumas das suas múltiplas funções. Na corrente sanguínea, também não ajuda a regular o grau de coagulação do sangue inibindo a agregação plaquetária. Dentre as fontes mais prováveis de não na corrente sanguínea é o nitrito, um íon inorgânico que tem sido mostrado para servir como um precursor do n. º Reagindo com glóbulos vermelhos (hemácias), o nitrito é reduzido a n e deoxyHb é oxidado a metahemoglobina¹. Não lançado de hemácias é vasoativas e faz com que vasorrelaxamento². Esta via de redução de nitrito não é uma alternativa pathway nenhuma geração, atuando junto com e não complementando a clássica nenhum caminho de geração pela endotelial de óxido nítrico sintase em condições de hipóxicos.

As plaquetas se não são capazes de reduzir o nitrito em não, mas são muito sensíveis à sua presença. Em plaquetas intactas, não no nanomolar gama aumenta GMPc (CE₅₀ = 10 nM) e fosforilação da VASP (CE₅₀ = 0,5 nM)³. Portanto, as plaquetas podem servir como um excelente sensor de redução de nitrito por hemácias e liberação no sangue. Existem vários métodos que podem diretamente a medir o grau de Ativação plaquetária - como aggregometry e tromboelastografia (TEG)^4,5. No entanto, estes métodos requerem instrumentação especializada cara e prefere grandes quantidades de material. Também é possível monitorar eventos a jusante, depois não é liberada de hemácias, usando as mudanças na expressão de proteínas de superfície de plaquetas – como P-selectina⁶. Não é também conhecida por aumentar a quantidade de cGMP em plaquetas⁷. Anteriormente, nós costumávamos cGMP monitorar sem libertação no sangue após a redução de nitrito por venoso RBC⁸. Isto provou para ser um método muito sensível; no entanto, cGMP é uma molécula de curta duração, e a sua detecção envolve extensa do trabalho. Outra possibilidade, descrita o protocolo apresentado, usa fosforilação do phospho vasodilatador-estimulada (VASP)-proteína para detectar a presença de n no sangue. VASP é um substrato de ativação de proteína quinase G, que é fosforilada mediante a interação com n através do sGC/cGMP via⁹. Detectável fosforilação VASP ocorre sem nenhum muito baixa concentrações, que poderiam fazer um detector muito sensível de nenhuma presença a plaquetas no sangue. VASP é altamente expresso em plaquetas, mas não em outras células do sangue, que permite seguir seletivamente os eventos envolvendo plaquetas¹⁰.

O objetivo principal do presente protocolo é descrever o método em detalhes para a detecção de liberação no sangue inteiro usando sua interação com as plaquetas, monitorando a VASP fosforilação^11,12. O método descrito permite detecção precoce de baixa sem concentrações - teoricamente na faixa nanomolar que torna o presente protocolo mais sensível do que a determinação de cGMP, devido ao uso de técnicas de padrão ocidental do borrão realizáveis em laboratório a maioria dos Configurações.

Protocolo

Nota: Amostras de sangue foram obtidas do banco de sangue do NIH (IRB aprovado protocolo: 99-CC-0168).

1. preparação da amostra sangue

Nota: Para evitar a ativação plaquetária, tirar sangue lentamente e misture suavemente com citrato o tubo várias vezes por inversão.

1. Preparação do plasma rico em plaquetas (PRP)
   1. Desenhar a 30-50 mL de sangue usando um 20g ou agulha de diâmetro maior e adicionar a um tubo contendo citrato de sódio (3.8%) em uma proporção de 1:9 ou citrato ácido dextrose (ACD) (citrato trissódico 85mm, ácido cítrico de 66,6 mM, glicose 111 mM, pH 4.5) na proporção de 1:6.
   2. Alíquota 5 mL de sangue recém coletado em vazios tubos cônicos de 15 mL. Centrifugar o sangue total em 120 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
   3. Cuidadosamente, recolha o sobrenadante contendo as plaquetas (plasma rico em plaquetas, PRP) de parte superior de uma pipeta de transferência plástico.
      Nota: PRP da etapa 1.1.3 está pronto para uso em experimentos ou para processamento adicional preparar lavou as plaquetas. A pelota macia obtida após centrifugação (etapa 1.1.2) contém glóbulos vermelhos e glóbulos brancos e pode ainda ser purificada para obter lavadas células vermelhas do sangue (RBC) — ver etapa 1.3. O experimento precisa ser terminado até 2 horas depois de tirar sangue. Ao coletar a PRP (sobrenadante), evite a coleção de buffy casaco contendo leucócitos acumulado na interface do PRP/RBC.
2. Preparação de plaquetas lavadas (opcional)
   1. Centrífuga coletadas PRP em 400 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e manter as pelotas de plaquetas.
   2. Lave delicadamente as pelotas pela adição de 5 mL de tampão CGS (120 mM de NaCl, glicose de citrato e 30mm trissódico 12,9 mM, pH 6,5) e centrifugar a 400 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
   3. Resuspenda as pelotas de plaquetas com 3 mL de tampão de Tyrode modificado (134 mM de NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2,9 mM KCl, 12mm NaHCO₃, 20mm HEPES, 1 mM MgCl₂, 2mm CaCl₂, pH de glicose 10 mM 7.4).
   4. Diluir as plaquetas (1: 100 — como exemplo, 10 µ l de plaquetas em 990 µ l da solução de Rees-Ecker) com solução de Rees Ecker e contagem por hemocytometer.
   5. Ajuste a densidade de plaquetas de 3 x 10⁸ células/mL pela adição de buffer de Tyrode.
   6. Incube a 37 ° C, durante 1 h a suspensão de plaquetas antes de iniciar o experimento.
      Nota: As plaquetas lavadas são estáveis durante 5 – 8 h a 37 ° C.
3. Preparação de glóbulos vermelhos lavados (RBC)
   1. Após a coleta, centrifugar a pelota macia obtida na fase 1.1.3 a 2.500 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
   2. Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento de RBC com 5 mL de PBS por centrifugação a 2.500 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Repita esta etapa para 3 vezes.
   3. Descartar a PBS e usar hemácias lavadas para novas experiências.

2. Desoxigenação

1. Adicione 1 mL da mistura de PRP (preparado na etapa 1.1.4. ou 1.2.4.) e hemácias (preparadas na etapa 1.3.) no hematócrito desejado em um frasco de polipropileno fechado com uma rolha de borracha. Por exemplo, em 20% do hematócrito, adicione 200 µ l de hemácias a 800 µ l de PRP.
   Nota: Sugeriu hematócritos estão entre 0% e até 40%. Não utilize um frasco de vidro ou balão como plaquetas aderem à superfície de vidro.
2. Insira a agulha conectada ao tanque de gás hélio para a garrafa fechada e fazer a saída de gás através da inserção de uma agulha 26G (Figura 1).
3. Lentamente, agite a garrafa à temperatura ambiente.
   Nota: Não permitir que o gás a borbulhar através de preparação de sangue. Fluxo de gás lento é preferível para este procedimento, e excessivamente rápido fluxo de gás leva à hemólise aumentada. O mais eficiente fluxo de gás deve ser determinado pelo julgamento, como altamente depende da geometria da instalação experimental.
4. Periodicamente, acompanhar o processo de Desoxigenação medindo a pressão parcial de oxigênio (pO₂) usando um CO-oxímetro.
   Nota: Em nossas mãos, 10 min de Desoxigenação diminui pO₂ a 25 mmHg, que é necessário para a redução de nitrito por hemácias. continuando Desoxigenação reduzir ainda mais pO₂ a 10 mmHg; no entanto, levou a hemólise aumentada e aumento da hemoglobina livre de células (Figura 2).

3. células vermelhas do sangue redução de nitrito

1. Adicione 1 mL de PBS (pH 7,4) num 0,0345 g de NaNO₂ para fazer 500 mM solução estoque de nitrito. Dilua 500 mM NaNO₂ a 250 µM NaNO₂ (x 25) de diluição serial em PBS (pH 7,4).
2. Usando uma microsseringa, injete nitrito (40 µ l) através do septo a amostra venoso de PRP e hemácias para alcançar concentrações finais de 10 µM em total 1 mL da amostra.
   Nota: Neste experimento, as concentrações finais de nitrito usado é de 10 µM.
3. Incube a amostra a 37 ° C durante 10 min ou mais.
   Nota: Ajuste a duração exata de incubação RBC com nitrito necessário para redução de nitrito máxima para diferentes tipos de experimentos.
4. Remova o bujão e Pipetar 1 mL da amostra para um tubo de microcentrifugadora.
5. Centrifugar a 200 x g durante 3 min à temperatura ambiente.
6. Pipetar 300 µ l da suspensão de plaquetas da porção superior do líquido sobrenadante e misturar com ACD (pH 6,5) na proporção de 1:9. Descarte a pelota de RBC.
7. Centrifugar a suspensão de plaquetas em 500 x g durante 4 min à temperatura ambiente.
8. Adicione 80 µ l de tampão de Lise gelada (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) contendo inibidor da protease cocktail III (1: 500) para a plaqueta de Pelotas.

4. mancha ocidental da VASP

1. Carga de 15 µ g da proteína de cada amostra para 2 separado 10% geles de SDS-PAGE.
   Nota: Buffer de descascamento dura, que contém b-Mercaptoetanol, não é possível remover anticorpos P-VASP^Ser239 e VASP da membrana; Portanto, P-VASP ^Ser239 e VASP devem ser executado separadamente.
2. Execute os géis em 120 V para h 1,30 e transferência para a membrana de nitrocelulose.
3. Bloco inespecificas com leite desnatado 5%.
4. Incubar a membrana com P-VASP^Ser239 (1: 500), VASP (1:1, 000) e GAPDH (1:1, 000) durante a noite a 4 ° C.
5. Incube o anticorpo secundário de horseradish peroxidase (HRP) com a membrana de 45 min à temperatura ambiente.
6. Expor a membrana com uma máquina de tonalizador e quantificar a densidade de banda usando o ImageJ.

Resultados

Amostras de sangue venoso tem valores de₂ pO entre 50 e 80 mmHg. Desoxigenação por Hélio diminui rapidamente pO₂ a 25 mmHg dentro de 10 min.₂pO um pouco mais tempo de Desoxigenação aumento diminui. No entanto, o aumento do tempo de Desoxigenação também leva a um significativamente aumento dos níveis de hemoglobina sem célula (determinado pelo CO-oxímetro, visualmente, visto na Figura 2 como cada vez mais vermelha co...

Discussão

Desde que as plaquetas são facilmente ativadas, suave manipulação de plaquetas contendo amostras é necessária. Pipetagem rápido e agitação vigorosa devem ser evitadas. Inibidores de plaquetas como a prostaciclina (PGI₂) podem ser usados para prevenir a ativação plaquetária; no entanto, isso pode afetar algumas vias de sinalização no interior das plaquetas. Para a preparação de pelotas de plaquetas, podemos adicionar ACD para as suspensões de plaquetas e usar centrifugação de baixa velocidade....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-sodium citrate	Supply by NIH blood bank
Citric acid	Supply by NIH blood bank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; sodium chloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; potassium chloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; sodium bicarbonate	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calcium chloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles	Nalgene	2089-0001
Red septum stopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; sodium nitrite	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody	Cell signaling technology	3114
VASP antibody	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer