Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um die mögliche Verwendung von Thrombozyten als hochsensible Stickoxid-Sensor im Blut zu beheben. Es beschreibt erste Thrombozyten Vorbereitung und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als Stickoxid-Generatoren.

Zusammenfassung

Blutplättchen sind verantwortlich für die ordnungsgemäße Blutgerinnung Blutbestandteilen. Ihre Funktion ist durch verschiedene Wege stark reguliert. Einer der potentesten vasoaktive Agenten, Stickstoffmonoxid (NO), kann auch als eine mächtige Inhibitor der Thrombozytenaggregation handeln. Direkt ist kein Nachweis im Blut sehr anspruchsvoll aufgrund seiner hohen Reaktivität mit zellfreien Hämoglobin, die keine Halbwertszeit bis Millisekundenbereich begrenzt. Derzeit keine Änderungen nach Interventionen nur geschätzt werden anhand der gemessenen Veränderungen von Nitrit und Nitrat (Mitglieder der Stoffwechselweg der Nitrat-Nitrit-NO). Aber genauer gesagt, sind diese Messungen eher schwierig zu interpretieren gegenüber tatsächlichen keine Änderungen aufgrund der natürlich hohe Ausgangswert Nitrit und Nitratgehalte, die mehrere Größenordnungen höher als erwarteten Veränderungen nicht allein sind. Die Entwicklung der direkte und einfache Methoden, die nicht direkt nachweisen lassen würde ist daher längst überfällig. Dieses Protokoll befasst sich einer möglichen Verwendung von Thrombozyten als eine hochsensible kein Sensor im Blut. Es beschreibt erste Thrombozyten rich Plasma (PRP) und gewaschenen Thrombozyten Vorbereitungen und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als keine Generatoren. Phosphorylierung von VASP an Serin 239 (P-VASP^Ser239) wird verwendet, um das Vorhandensein von Nr. Die Tatsache, dass VASP Proteins sich besonders in Thrombozyten drückt und dass es schnell phosphoryliert wird, wenn keine vorhanden führt zu eine einmalige Gelegenheit, diesen Weg nutzen, um direkt ohne Präsenz im Blut nachweisen.

Einleitung

Thrombozyten sind scheibenförmige kleinzelligen Fragmente aus Megakaryozyten, die entscheidend für die Blutgerinnung sind abgeleitet. Die gerinnende Kaskade wird von verschiedenen bioaktiven Moleküle (wie Kollagen oder ADP), veröffentlicht nach der Verletzung der Gefäßwand initiiert. Die Prozess der Blutgerinnung kann unter verschiedenen Effektoren von Stickstoffmonoxid (NO) geändert werden. Nein, natürlich von Säugerzellen produziert, ist eines der vielseitigsten physiologische Signale. Es wirkt als potenter Vasodilatator, Neurotransmitter und immun-Modulator, einige seiner vielen Funktionen zu nennen. In der Blutbahn hilft auch keine, um das Ausmaß der Blutgerinnung durch Hemmung der Thrombozytenaggregation zu regulieren. Die wahrscheinlichsten Ursachen von NO in den Blutkreislauf zählt Nitrit, eine anorganische Ionen, die gezeigt worden, um als ein Vorläufer der Nr. dienen Reaktion mit roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Nitrit reduziert sich auf NO und DeoxyHb ist oxidiert zu Methämoglobin (MetHb)¹. Nein von Erythrozyten befreit vasoaktive und verursacht Vasorelaxation². Dieses Nitrit-Reduktion-Weg ist eine Alternative keine Generation Weg zusammen mit handeln und Ergänzung der klassischen keine Generation Weg durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase unter hypoxischen Bedingungen.

Thrombozyten selbst sind nicht in der Lage, Nitrit in NO zu reduzieren, sondern reagieren sehr empfindlich auf ihre Präsenz. In intakten Blutplättchen, nicht in die nanomolaren Reichweite erhöht cGMP (EG₅₀ = 10 nM) und Phosphorylierung von VASP (EG₅₀ = 0,5 nM)³. Thrombozyten können dienen daher als hervorragende Sensor von Nitrit Abbau von Erythrozyten und keine Freisetzung ins Blut. Es gibt mehrere Methoden, die das Ausmaß der Thrombozyten Aktivierung - wie Aggregometry und Thromboelastography (TEG) direkt messen^4,5. Diese Methoden erfordern jedoch teuer spezialisierte Instrumentierung und ziemlich große Mengen an Material. Es ist auch möglich, Ereignisse überwachen nachgeschalteten, nach NO wird freigegeben von Erythrozyten, Thrombozyten-Oberfläche Protein-Expression – z. B. P-Selektin⁶Änderungen bei. Nein ist auch bekannt, die Menge an cGMP in der Thrombozyten-⁷erhöhen. Früher wir cGMP keine Freisetzung ins Blut nach der Nitrit-Reduzierung durch sauerstoffarmes RBC⁸zu überwachen. Dies erwies sich als eine sehr empfindliche Methode; Allerdings cGMP ist eine kurzlebige Molekül und seine Entdeckung beinhaltet umfangreiche Arbeit. Eine weitere Möglichkeit, beschrieben in dem vorgestellten Protokoll verwendet Phosphorylierung von gefäßerweiternden stimuliert Phospho (VASP)-Protein, das Vorhandensein von NO im Blut zu erkennen. VASP ist ein Substrat aus Protein Kinase G Aktivierung, die auf die Interaktion mit Nein durch die sGC/cGMP Weg⁹phosphoryliert wird. Nachweisbare VASP Phosphorylierung tritt bei sehr niedrigen NO-Konzentrationen, die Blutplättchen im Blut einen sehr empfindlichen Detektor keine Präsenz machen könnte. VASP hoch in Thrombozyten angegeben, jedoch nicht in anderen Blutkörperchen, wodurch gezielt die Ereignisse im Zusammenhang mit Thrombozyten¹⁰folgen.

Das Hauptziel dieses Protokolls soll die Methode im Detail für den Nachweis von keine Freigabe im Vollblut mit seiner Interaktion mit Thrombozyten durch die Überwachung der VASP Phosphorylierung^11,12beschreiben. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Früherkennung von niedrigen keine Konzentrationen - theoretisch im nanomolaren Bereich macht dieses Protokolls empfindlicher als cGMP Bestimmung, durch die Verwendung von standard-Western-Blot-Techniken, die in die meisten Labor erreichbare Einstellungen.

Protokoll

Hinweis: Blutproben wurden von NIH Blutbank erhalten (IRB Protokoll genehmigt: 99-CC-0168).

(1) Blut Probenaufbereitung

Hinweis: Zur Vermeidung von Thrombozyten Aktivierung Blut langsam und vorsichtig mischen mit Citrat durch das Rohr mehrmals umdrehen.

1. Platelet-Rich Plasma (PRP) Vorbereitung
   1. Ziehen Sie 30 – 50 mL Blut mit einem 20 G oder größeren Durchmesser Nadel und fügen Sie in ein Röhrchen mit Natriumcitrat (3,8 %) in einer 1:9 Ratio oder Acid Citrat Dextrose (ACD) (85 mM Trinatrium Citrat, 66,6 mM Zitronensäure, 111 mM Glukose, pH 4,5) im Verhältnis 1:6.
   2. Aliquoten 5 mL frisch gesammelten Vollblut in leer 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 120 X g für 10 min bei Raumtemperatur.
   3. Sorgfältig sammeln des Überstands enthält die Blutplättchen (Thrombozyten-Reiches Plasma, PRP) aus dem oberen Teil durch eine Kunststoff Transferpipette.
      Hinweis: PRP aus Schritt 1.1.3 ist bereit für den Einsatz in Experimente oder für die Weiterverarbeitung vorbereiten gewaschen Thrombozyten. Das weiche Pellet nach Zentrifugation (Schritt 1.1.2) den Erythrozyten und Leukozyten enthält und kann weitere erhalten gereinigt, um gewaschene Erythrozyten (RBC) erhalten – siehe Schritt 1.3. Das Experiment muss fertig innerhalb von 2 Stunden nach der Blutentnahme. Beim Sammeln von PRP (überstand) vermeiden Sie die Sammlung von buffy Coat-haltigen Leukozyten auf der PRP/RBC Oberfläche angesammelt.
2. Gewaschene Thrombozyten Vorbereitung (optional)
   1. Zentrifuge gesammelt PRP bei 400 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen und die Thrombozyten Pellets.
   2. Waschen Sie vorsichtig die Pellets durch Zugabe von 5 mL CGS Puffer (120 mM NaCl, Trinatrium Citrat und 30 mM Glukose 12,9 mM, pH 6,5) und Zentrifuge bei 400 X g für 10 min bei Raumtemperatur.
   3. Aufschwemmen der Thrombozyten-Pellets mit 3 mL modifizierte Tyrode-Puffer (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2,9 mM KCl, 12 mM Nahco3₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM Glukose pH 7.4).
   4. Verdünnen der Thrombozyten (1: 100 – beispielsweise 10 µL Thrombozyten in 990 µL Rees-Ecker-Lösung) mit Rees Ecker Lösung und Graf von Hemocytometer.
   5. Passen Sie die Dichte der Thrombozyten, 3 x 10⁸ Zellen/mL durch Zugabe von Tyrode-Puffer.
   6. Inkubieren Sie die Thrombozytenzahl Aussetzung bei 37 ° C für 1 h vor Beginn des Experiments.
      Hinweis: Gewaschene Thrombozyten sind stabil für 5 – 8 h bei 37 ° C.
3. Vorbereitung der gewaschenen Erythrozyten (RBC)
   1. Zentrifugieren Sie nach der Sammlung die weichen Pellet in Schritt 1.1.3 bei 2.500 X g für 10 min bei Raumtemperatur erhalten.
   2. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das RBC-Pellet mit 5 mL PBS durch Zentrifugation bei 2.500 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt für 3 Mal.
   3. Entsorgen der PBS und gewaschene Erythrozyten für weitere Experimente verwenden.

(2) Sauerstoffabspaltung

1. Fügen Sie 1 mL der Mischung von PRP (erstellt in Schritt 1.1.4. oder 1.2.4.) und Erythrozyten (vorbereitet in Schritt 1.3.) auf die gewünschte Hämatokrit in eine Polypropylen-Flasche mit einem Gummistopfen verschlossen. Zum Beispiel bei 20 % Hämatokrit fügen Sie 200 µL der Erythrozyten 800 µL PRP hinzu.
   Hinweis: Vorgeschlagenen Hämatokritwerte von 0 % bis zu 40 %. Verwenden Sie keine Glasflasche oder Kolben, da Thrombozyten Glasoberfläche einhalten.
2. Stechen Sie die Nadel mit Helium-Gas-Tank in der geschlossenen Flasche verbunden und machen Sie den Gasaustritt durch eine 26 G Nadel (Abbildung 1).
3. Langsam schwenken die Flasche bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Lassen Sie sich nicht He Gas durch Blut Vorbereitung Blasen wirft. Langsam Gas Flow ist für dieses Verfahren vorzuziehen, und übermäßig schnell He Gasstrom führt zu erhöhte Hämolyse. Der effizienteste Gasstrom muss durch Versuch, bestimmt werden, da es stark von der Geometrie des experimentellen Aufbaus abhängt.
4. In regelmäßigen Abständen folgen Sie Sauerstoffabspaltung Prozess durch die Messung des partiellen Sauerstoffdruck (pO-₂) mit einem Co Oximeter.
   Hinweis: In unseren Händen 10 min Sauerstoffabspaltung sinkt pO₂ bis 25 MmHg ist erforderlich für Nitrit Abbau von Erythrozyten. Fortsetzung Sauerstoffabspaltung weiter pO₂ um 10 MmHg reduzieren; Es führte jedoch zu erhöhten Hämolyse und eine Erhöhung der zellfreien Hämoglobin (Abbildung 2).

3. rote Blutzelle-Nitrit Reduktion

1. Fügen Sie 1 mL PBS (pH 7,4) in 0,0345 g NaNO₂ 500 mM Stammlösung von Nitrit zu machen. Verdünnen Sie 500 mM NaNO₂ bis 250 µM NaNO₂ (25 X) durch serielle Verdünnung mit PBS-Puffer (pH 7,4).
2. Mit einem Microsyringe, injizieren Sie Nitrit (40 µL) durch das Septum in die sauerstoffarmes Stichprobe von PRP und Erythrozyten Endkonzentrationen von 10 µM in insgesamt 1 mL der Probe zu erreichen.
   Hinweis: In diesem Experiment ist die Endkonzentrationen von Nitrit verwendet 10 µM.
3. Inkubation der Probe bei 37 ° C für 10 Minuten oder länger.
   Hinweis: Stellen Sie die genaue Dauer der RBC Inkubation mit Nitrit für maximale Nitrit Ermäßigung für verschiedene Arten von Experimenten benötigt.
4. Entfernen Sie stopfen und Pipette 1 mL der Probe zu einem Microcentrifuge Schlauch.
5. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 3 min bei Raumtemperatur.
6. Pipette 300 µL der Thrombozytenzahl Aussetzung aus dem oberen Teil des Überstands und mischen mit ACD (pH 6,5) im Verhältnis 1:9. Entsorgen Sie das RBC-Pellet.
7. Zentrifugieren Sie die Thrombozytenzahl Aussetzung bei 500 X g für 4 min bei Raumtemperatur.
8. Fügen Sie 80 µL eiskalte Lyse Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5 % NP-40, pH 7.4) mit Protease-Inhibitor cocktail III (1: 500), die Thrombozyten pellets.

4. westliche Beflecken von VASP

1. Laden Sie 15 µg des Proteins von jeder Probe in 2 separaten 10 % SDS-PAGE Gelen.
   Hinweis: Rauen abstreifenden Puffer, die b-Mercaptoethanol enthält, kann nicht P-VASP^Ser239 und VASP Antikörper aus der Membran entfernt werden; P-VASP ^Ser239 und VASP sollten daher separat ausgeführt werden.
2. Führen Sie die Gele bei 120 V für 1,30 h und Übertragung der Nitrozellulose-Membran.
3. Block unspezifische Bindung mit 5 % fettfreie Trockenmilch.
4. Inkubieren Sie die Membran mit P-VASP^Ser239 (1: 500), VASP (1:1 000) und GAPDH (1:1 000) für eine Nacht bei 4 ° c
5. Inkubieren Sie Meerrettich-Peroxidase (HRP) sekundäre Antikörper mit der Membran für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Setzen Sie die Membran mit einer Imager-Maschine und Quantifizierung der Band-Dichte mit ImageJ.

Ergebnisse

Venöse Blutproben haben pO₂ Werte zwischen 50-80 MmHg. Sauerstoffabspaltung durch Helium sinkt rasch pO₂ bis 25 MmHg innerhalb von 10 min. erhöhte Sauerstoffabspaltung mal etwas weiter sinkt pO₂. Erhöhte Zeit Sauerstoffabspaltung führt jedoch auch zu deutlich erhöhten Werten von zellfreien Hämoglobin (bestimmt durch Co Oximeter, visuell auf Abbildung 2 als zunehmend rote Färbung des Plasma gesehen) (

Diskussion

Da Thrombozyten leicht aktiviert werden, schonendes Handling von Thrombozyten-haltigen Proben erforderlich ist. Schnellen pipettieren und kräftig schütteln sollte vermieden werden. Thrombozyten-Hemmer wie Prostazyklin (PGI₂) können verwendet werden, um Thrombozyten Aktivierung zu verhindern; Dies kann jedoch einige Signalwege innerhalb der Blutplättchen beeinflussen. Für die Vorbereitung von Thrombozyten Pellets wir die Thrombozyten-Suspensionen ACD hinzufügen und langsamem Zentrifugation verwenden.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-sodium citrate	Supply by NIH blood bank
Citric acid	Supply by NIH blood bank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; sodium chloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; potassium chloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; sodium bicarbonate	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calcium chloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles	Nalgene	2089-0001
Red septum stopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; sodium nitrite	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody	Cell signaling technology	3114
VASP antibody	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer