Detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de VASP fosforilación

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para abordar el uso potencial de las plaquetas como un sensor altamente sensible de óxido nítrico en la sangre. Describe la preparación de plaquetas inicial y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos como generadores de óxido nítrico.

Resumen

Las plaquetas son los componentes de la sangre responsables de coagulación de la sangre adecuada. Su función es altamente regulada por diversas vías. Uno de los más potentes agentes vasoactivos óxido nítrico (NO), también puede actuar como un potente inhibidor de la agregación plaquetaria. Directo detección en sangre no es muy difícil debido a su alta reactividad con la hemoglobina libre que no limita Half-Life a la gama del milisegundo. Actualmente, ningún cambio después de las intervenciones sólo se calculan basado en los cambios medidos de nitrito y nitrato (miembros de la vía metabólica de nitrato-nitrito-NO). Sin embargo precisa, estas mediciones son más bien difíciles de no interpretar frente a real cambios, debido al nitrito inicial alto y niveles que son varios órdenes de magnitud mayores que los cambios esperados NO sí mismo del nitrato. Por lo tanto, el desarrollo de métodos simples y directos que le permiten detectar directamente NO es mucho. Este protocolo dirige a un potencial uso de plaquetas como altamente sensibles sin sensor en sangre. Califica de plasma rico en plaquetas inicial (PRP) y preparados de plaquetas lavadas y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos NO generadores. Fosforilación de la VASP en serina 239 (P-VASP^Ser239) se utiliza para detectar la presencia de NO. El hecho de que proteínas VASP se expresaron altamente en las plaquetas y que se fosforila rápidamente cuando NO está presente conduce a una oportunidad única para utilizar esta vía para detectar directamente la presencia en sangre.

Introducción

Las plaquetas son fragmentos de células pequeñas en forma de disco, derivados de megacariocitos que son cruciales para la coagulación de la sangre. La cascada de coagulación se inicia por diversas moléculas bioactivas (como colágeno o ADP), publicadas después de la lesión de pared vascular. El proceso de coagulación de la sangre puede ser modificada, entre varios generadores de óxido nítrico (NO). NO, producida naturalmente por las células de mamífero, es una de las señales fisiológicas más versátiles. Actúa como un potente vasodilatador, neurotransmisor y modulador inmune, por nombrar algunos de sus múltiples funciones. En el torrente sanguíneo, NO también ayuda a regular el grado de coagulación de la sangre al inhibir la agregación plaquetaria. Una de las fuentes más probables de NO en el torrente sanguíneo es el nitrito, un ion inorgánico que se ha demostrado para servir como un precursor del NO. Reaccionan con los glóbulos rojos (gr), nitrito se reduce a NO y deoxyHb se oxida a metahemoglobina (metHb)¹. NO liberado de los glóbulos rojos es vasoactivo y causa vasorelaxation². Esta vía de la reducción del nitrito es suplente NO generación, actuando junto con y no complementa el clásico ningún camino de generación de óxido nítrico sintasa endotelial en condiciones hipóxicas.

Las plaquetas no se son capaces de reducir el nitrito a NO, pero son muy sensibles a su presencia. En plaquetas intactas, NO en el nanomolar gama aumenta el GMPC (EC₅₀ = 10 nM) y fosforilación de VASP (EC₅₀ = 0,5 nM)³. Por lo tanto, las plaquetas pueden servir como un excelente sensor de reducción de nitritos por los glóbulos rojos y no hay liberación en sangre. Hay varios métodos que pueden medir directamente el grado de activación de las plaquetas - Tromboelastografía (TEG) como aggregometry de^4,5. Sin embargo, estos métodos requieren costosos instrumentos especializados y grandes cantidades de material. También es posible monitorizar eventos río abajo, después NO es liberado de los glóbulos rojos, con los cambios en la expresión de proteína de la superficie plaquetaria – tales como P-selectina⁶. NO también se conoce para aumentar la cantidad de GMPC en las plaquetas⁷. Anteriormente, solíamos cGMP no supervisar ninguna liberación en sangre después de la reducción de nitrito por desoxigenada RBC⁸. Esto resultó para ser un método muy sensible; sin embargo, cGMP es una molécula de breve duración y su detección implica mano de obra extensa. Otra posibilidad, descrito en el protocolo presentado, utiliza la fosforilación de la fosfo estimulada por vasodilatador (VASP)-proteína para detectar la presencia de NO en sangre. VASP es un sustrato de la activación de proteína quinasa G, que es fosforilado a la interacción con NO a la sGC/cGMP pathway⁹. Fosforilación de VASP detectarse ocurre en NO muy baja concentraciones, que podrían hacer que las plaquetas un detector muy sensible de NO presencia en la sangre. VASP se expresa altamente en las plaquetas, pero no en otras células de la sangre, que permite para seguir selectivamente los acontecimientos que involucran a las plaquetas¹⁰.

El objetivo principal de este protocolo es describir el método detalladamente para la detección de ninguna liberación en sangre entera mediante su interacción con las plaquetas mediante el control de VASP fosforilación^11,12. El método descrito no permite la detección temprana de baja las concentraciones - teóricamente en el rango nanomolar que hace más sensible que la determinación de la cGMP, debido al uso de técnicas de Western blot estándar alcanzables en laboratorio la mayoría del presente Protocolo Configuración.

Protocolo

Nota: Se obtuvieron muestras de sangre de banco de sangre del NIH (IRB aprobó protocolo: CC-99-0168).

1. preparación de muestras de sangre de

Nota: Para evitar la activación plaquetaria, extraer la sangre lentamente y mezclar suavemente con el citrato invirtiendo el tubo varias veces.

1. Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP)
   1. Dibujar 30 – 50 mL de sangre con una 20 G o aguja de diámetro más grande y añadir en un tubo que contiene citrato de sodio (3.8%) en una proporción 1:9 o dextrosa citrato ácido (ACD) (citrato trisódico 85 mM, 66,6 mM cítrico ácido, glucosa 111 mM, pH 4.5) en una proporción de 1:6.
   2. Alícuota 5 mL de sangre recién recolectado en tubos cónicos de 15 mL vacíos. Centrifugar sangre 120 x g por 10 min a temperatura ambiente.
   3. Recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene las plaquetas (plasma rico en plaquetas, PRP) de la parte superior por una pipeta de transferencia plástica.
      Nota: PRP del paso 1.1.3 está listo para su uso en experimentos o para su posterior procesamiento preparar lava las plaquetas. El sedimento suave obtenido después de centrifugación (paso 1.1.2) contiene células de sangre rojas y células blancas y puede ser más purificado para obtener lavados glóbulos rojos (RBC): véase el paso 1.3. El experimento debe ser terminada dentro de 2 h después de extraer sangre. Al recoger el PRP (sobrenadante), evitar la colección de leucocitos que contiene la capa buffy acumulado en la interfaz PRP, gr.
2. Preparación de plaquetas lavadas (opcional)
   1. Centrífuga recogido PRP a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y conservar los gránulos de la plaqueta.
   2. Lave suavemente las pelotillas añadiendo 5 mL de tampón CGS (glucosa trisodio de citrato y 30 mM de 12,9 mM, 120 mM NaCl, pH 6,5) y centrifugar a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
   3. Vuelva a suspender los pellets de plaquetas con 3 mL de buffer Tyrode modificado (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM glucosa pH 7.4).
   4. Diluir las plaquetas (1: 100, como ejemplo, 10 μl de las plaquetas en 990 μl de solución de Rees Ecker) con solución de Rees Ecker y cuenta por hemocitómetro.
   5. Ajustar la densidad de las plaquetas a 3 x 10⁸ células/mL mediante la adición de buffer Tyrode.
   6. Incubar la suspensión de plaquetas a 37 ° C durante 1 hora antes de comenzar el experimento.
      Nota: Plaquetas lavadas son estables durante 5 – 8 h a 37 ° C.
3. Preparación de lavado de glóbulos rojos (RBC)
   1. Después de la colección, centrifugar el sedimento suave obtenido en el paso 1.1.3 a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
   2. Deseche el sobrenadante y lavar el pellet de RBC con 5 mL de PBS por centrifugación a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Repetir esta operación 3 veces.
   3. Descartar el PBS y los glóbulos rojos lavados para experimentos adicionales.

2. detracción de oxígeno

1. Añadir 1 mL de la mezcla de PRP (preparado en el paso 1.1.4. o 1.2.4.) y los glóbulos rojos (preparados en el paso 1.3.) en el hematocrito deseado en una botella de polipropileno cerrado con un tapón de caucho. Por ejemplo, en el 20% de hematocrito, añadir 200 μL de glóbulos rojos a 800 μl de PRP.
   Nota: Sugerido los hematocritos son de 0% hasta un 40%. No utilice una botella de cristal o frasco que las plaquetas se adhieren a la superficie de vidrio.
2. Inserte la aguja conectada al tanque de gas de helio dentro de la botella cerrada y hacer la salida de gas inserción de una aguja de 26 G (figura 1).
3. Agite lentamente la botella a temperatura ambiente.
   Nota: No permita que el gas de la burbuja a través de la preparación de la sangre. Flujo de gas lento es preferible para este procedimiento, y flujo de gas de excesivamente rápida conduce a hemólisis creciente. El flujo de gas más eficiente debe determinarse por ensayo, ya que depende altamente de la geometría de la instalación experimental.
4. Seguir periódicamente el proceso de desoxigenación mediante la medición de la presión parcial de oxígeno (pO₂) con un cooxímetro.
   Nota: En nuestras manos, a 10 min de detracción de oxígeno disminuye pO₂ a 25 mmHg que se requiere para la reducción de nitrito por gr. continuar desoxigenación adicional reducir pO₂ a 10 mmHg; sin embargo, condujo al aumento de la hemólisis y aumento de hemoglobina libre (figura 2).

3. glóbulos rojos nitrito reducción

1. Añadir 1 mL de PBS (pH 7.4) en 0,0345 g de NaNO₂ 500 mM solución stock de nitrito. Diluir 500 mM NaNO₂ a 250 μm NaNO₂ (25 x) por dilución seriada en PBS (pH 7.4).
2. Usar una microjeringa, inyectar nitrito (40 μL) a través del tabique la desoxigenada muestra de PRP y los glóbulos rojos para obtener concentraciones finales de 10 μm en total 1 mL de muestra.
   Nota: En este experimento las concentraciones finales de nitrito usado es 10 μm.
3. Incubar la muestra a 37 ° C durante 10 minutos o más.
   Nota: Ajuste la duración exacta de la incubación de RBC con nitrito necesaria para la reducción de nitrito máximo para diferentes tipos de experimentos.
4. Retire el tapón y la pipeta 1 mL de la muestra en un tubo de microcentrífuga.
5. Centrifugue a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
6. Con una pipeta 300 μL de la suspensión de plaquetas de la porción superior del sobrenadante y mezclar con ACD (pH 6.5) con una relación 1:9. Deseche los pellets de RBC.
7. Centrifugue la suspensión de plaquetas a 500 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
8. Agregar 80 μl de tampón de lisis helada (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) con inhibidor de la proteasa bolitas de Cóctel III (1: 500) de las plaquetas.

4. Western Blotting de VASP

1. Carga 15 μg de la proteína de cada muestra para 2 geles de SDS-PAGE 10% separados.
   Nota: Buffer extracción áspero, que contiene el b-mercaptoetanol, no puede quitar los anticuerpos P-VASP^Ser239 y VASP de la membrana; por lo tanto, P-VASP ^Ser239 y VASP deben realizarse por separado.
2. Funcionan los geles 120 V para la 1,30 h y transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
3. Fijación no específica de bloque con 5% leche en polvo descremada.
4. Incubar la membrana con P-VASP^Ser239 (1: 500), VASP (1:1, 000) y GAPDH (1:1, 000) para pasar la noche a 4 ° C.
5. Incubar anticuerpo secundario de peroxidasa (HRP) de rábano con la membrana por 45 min a temperatura ambiente.
6. Exponer la membrana con una máquina de imager y cuantificar la densidad de la banda con ImageJ.

Resultados

Muestras de sangre venosa tienen valores de pO₂ entre 50-80 mmHg. Desoxigenación por helio disminuye rápidamente la pO₂ a 25 mmHg dentro de 10 minutos mayor detracción de oxígeno tiempo un poco más disminuciones pO₂. Sin embargo, aumento del tiempo de detracción de oxígeno conduce también a significativamente mayores niveles de hemoglobina libre (determinada por co-oximetría, visualmente vista en la figura 2 como colo...

Discusión

Puesto que las plaquetas se activan fácilmente, suave manejo de plaquetas que contienen las muestras se requiere. Debe evitarse uso rápido y vigoroso. Plaquetarios tales como prostaciclina (PGI₂) pueden utilizarse para prevenir la activación plaquetaria; sin embargo, esto puede afectar algunas vías de señalización dentro de las plaquetas. Para la preparación de gránulos de la plaqueta, añadir ACD a las suspensiones de plaquetas y utilizar centrifugación a baja velocidad.

R...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-sodium citrate	Supply by NIH blood bank
Citric acid	Supply by NIH blood bank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; sodium chloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; potassium chloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; sodium bicarbonate	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calcium chloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles	Nalgene	2089-0001
Red septum stopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; sodium nitrite	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody	Cell signaling technology	3114
VASP antibody	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer