Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Özet

Burada, trombosit potansiyelini kullanmak son derece hassas nitrik oksit sensör kan olarak adrese bir iletişim kuralı mevcut. Nitrik oksit jeneratörler ilk trombosit hazırlık ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar.

Özet

Trombosit kan bileşenleri uygun kan pıhtılaşması için sorumlu vardır. Onların işlevi son derece çeşitli yolları tarafından düzenlenir. En güçlü vazoaktif ajanlar, nitrik oksit (NO), biri de trombosit toplama güçlü bir inhibitörü olarak hareket edebilir. Doğrudan hiçbir algılama kan yok half-life milisaniyelik aralığı için sınırlar boş hücre hemoglobin ile onun yüksek reaktivite nedeniyle çok zor olduğunu. Şu anda, müdahaleler sadece tahmin edilir sonra herhangi bir değişiklik, nitrit ve nitrat (nitrat-nitrit-Hayır metabolik yolu üyeleri) ölçülen değişiklikleri dayalı. Ancak kesin, bu ölçümler vis bir vis gerçek doğal olarak yüksek temel nitrit nedeniyle herhangi bir değişiklik yorumlamak ve büyüklükte birkaç emir hiçbir kendisinin beklenen değişiklikler yüksek düzeylere nitrat oldukça zordur. Bu nedenle, bir Hayır doğrudan algılamak olanak sağlayacak doğrudan ve basit yöntem geliştirme gecikmiş olduğunu. Bu iletişim kuralı hiçbir sensör kan trombosit olarak son derece hassas bir potansiyel kullanımı giderir. HİÇBİR jeneratörler ilk trombosit zengin plazma (PRP) ve yıkanmış trombosit preparatları ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar. VASP fosforilasyon, serin 239 (P-VASP^Ser239) No var olup olmadığını belirlemek için kullanılır VASP protein yüksek trombosit ifade edilir ve bu hızla oluşturulduğunda fosforile da mevcuttur aslında doğrudan kan içinde yok olup olmadığını belirlemek için bu yolu kullanmak için eşsiz bir fırsat yol açar.

Giriş

Trombosit kan pıhtılaşması için çok önemli megakaryocytes türetilen küçük hücreli disk şeklindeki oluşuyor. Pıhtılaşma cascade vasküler duvar yaralanma sonra yayımlanan çeşitli biyoaktif molekülleri (örneğin, kollajen veya ADP) tarafından başlatılır. Kan pıhtılaşma işlemi, nitrik oksit (NO) tarafından çeşitli effectors arasında değiştirilebilir. Hayır, doğal memeli hücreleri tarafından üretilen, çok yönlü fizyolojik sinyalleri biridir. Bir güçlü vazodilatör, nörotransmitter ve birçok işlevleri bir kaç isim için bağışıklık modülatör olarak davranır. Kan dolaşımında, Hayır da pıhtılaşması kan trombosit toplama engelleyerek ölçüde düzenleyecek yardımcı olur. No kan olasılıkla kaynaklarından biridir nitrit, No bir habercisi hizmet etmek için gösterilen bir inorganik iyon Kırmızı kan hücreleri (RBCs) ile tepki, nitrit Hayır olarak azalır ve deoxyHb methemoglobin (metHb)¹' e okside. Hayır RBCs yayımlanan vazoaktif ve vasorelaxation²neden olur. Bu nitrit azaltma yolu bir başka hiçbir üretimi, ile birlikte hareket eden ve klasik üretimi yol hipoksik koşulları, endotelyal nitrik oksit sentaz tarafından tamamlayan yoludur.

Trombosit kendilerini nitrit NO azaltmak mümkün değildir ama onun hazır bulunma için çok hassas. Sağlam trombosit içinde nanomolar içinde Hayır cGMP aralığını artırır (EC₅₀ = 10 nM) ve fosforilasyon VASP (EC₅₀ 0,5 = nM)³. Bu nedenle, trombosit mükemmel bir sensör nitrit azaltma RBCs ve hiçbir yayın kana olarak sunabilir. Trombosit aktivasyon - aggregometry ve Tromboelastografi (TEG) gibi ölçüde doğrudan ölçebilirsiniz birkaç yöntem vardır^4,5. Ancak, bu yöntem pahalı özel araçları ve malzeme oldukça büyük miktarda gerektirir. Aynı zamanda mümkün olan olayları izlemek aşağı akım, Hayır sonra RBCs, platelet yüzey protein ifadesindeki –⁶P-selektin gibi değişiklikleri kullanarak üzerinden serbest bırakılır. Hayır da trombosit⁷cGMP miktarını artırmak için bilinir. Daha önce biz hiçbir yayın içine kan deoxygenated RBC⁸tarafından nitrit azaltma sonra izlemek için cGMP kullanılır. Bu çok hassas bir yöntem olduğunu kanıtladı; Ancak, cGMP kısa ömürlü bir moleküldür ve geniş iş onun algılama içerir. Başka bir olasılık, sunulan protokolünde açıklanan vazodilatör uyarılmış Fosfo (VASP) fosforilasyon kullanır-Hayır kan içinde var olup olmadığını belirlemek için protein. VASP bir substrat-sGC/cGMP yolu⁹NO ile etkileşim üzerine fosforile protein kinaz G etkinleştirme var. Algılanabilir VASP fosforilasyon oluşur çok düşük Hayır konsantrasyonları, trombosit kanda herhangi bir varlığı çok hassas bir dedektör yapabiliriz. VASP yüksek trombosit ifade edilir, ancak diğer kan hücreleri seçerek trombosit¹⁰içeren olayları takip etmek sağlayan değil.

Bu iletişim kuralının temel amacı ayrıntılı yöntemi tam kan trombosit ile etkileşimi VASP fosforilasyon^11,12izleyerek kullanarak hiçbir sürümde tespiti için tarif etmektir. Açıklanan yöntemi düşük erken teşhis yok konsantrasyonları - teorik olarak mevcut iletişim kuralı standart Western blot ulaşılabilir teknikleri çoğu laboratuvar kullanımı nedeniyle cGMP belirlenmesi daha duyarlı kılan nanomolar aralığında sağlar Ayarlar.

Protokol

Not: Kan örnekleri NIH Kan Bankası'ndan elde (IRB onaylı protokolü: 99-CC-0168).

1. kan örnek hazırlama

Not: Trombosit aktivasyon önlemek için yavaş yavaş kan alıp birkaç kez tüp ters çevirme tarafından sitrat ile karışımı yavaşça.

1. Trombosit açısından zengin plazma (PRP) hazırlık
   1. 30 – 50 mL kan bir 20 G veya daha büyük çaplı iğne kullanarak çizmek ve 1:9 oranı veya asit sitrat Dekstroz (ACD) (85 mM TRISODYUM sitrat, 66.6 mM sitrik asit, 111 mM glikoz, pH 4.5) 1:6 oranında sodyum sitrat (% 3.8) içeren bir tüp içine ekleyin.
   2. Aliquot 5 mL taze toplanan tam kan boş 15 mL konik tüpler içine de. Tam kan, 120 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
   3. Dikkatle trombosit (trombosit açısından zengin plazma, PRP) içeren süpernatant üst kısımlarından bir plastik transfer pipet ile toplamak.
      Not: 1.1.3. adımdaki PRP deneylerde kullanılmaya hazır durumda olan veya daha fazla işlem için hazırlamak için trombosit yıkanmış. Santrifüjü (adım 1.1.2) kırmızı kan hücreleri ve beyaz hücreler içerir ve daha fazla olabilir elde edilen yumuşak Pelet yıkanmış kırmızı kan hücreleri (RBC) elde etmek için saf — adım 1.3. görmek Deneme kan çizdikten sonra içinde 2 h bitmiş olması gerekir. PRP (süpernatant) toplarken, PRP/RBC arabirim üzerinde birikmiş buffy kat içeren lökosit topluluğu kaçının.
2. Yıkanmış trombosit hazırlık (isteğe bağlı)
   1. Santrifüj PRP 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de toplanan. Süpernatant atın ve trombosit granül koruyun.
   2. Yavaşça granül 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de 5 mL CGS tampon (120 mM NaCl, 12.9 mM TRISODYUM sitrat ve 30 mM glikoz, pH 6,5) ve santrifüj de ekleyerek yıkayın.
   3. Trombosit granül değiştirilmiş Tyrode arabellek (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM glikoz pH 7,4) 3 mL ile resuspend.
   4. Trombosit seyreltik (1: 100 — örnek olarak, trombosit 990 µL Rees-Ecker çözüm içinde 10 µL) Rees Ecker çözüm ve hemasitometre olarak say.
   5. Trombosit 3 x 10⁸ hücre/ml yoğunluğu Tyrode arabelleği ekleyerek ayarlayın.
   6. Trombosit süspansiyon için 1 h 37 ° C'de deneme başlamadan önce kuluçkaya.
      Not: Yıkanmış trombosit için 5-8 h 37 ° C'de sabit
3. Yıkanmış kırmızı kan hücreleri (RBC) hazırlanması
   1. Toplandıktan sonra adım 1.1.3 2500 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de elde yumuşak Pelet santrifüj kapasitesi.
   2. Süpernatant atın ve 2500 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de RBC Pelet PBS 5 mL aralıklarla tarafından ile yıkayın. Bu adım için 3 kez tekrarlayın.
   3. PBS atın ve yıkanmış RBCs daha fazla deneyler için kullanın.

2. deoxygenation

1. 1 mL PRP karışımı ekleyin (1.1.4 adımda hazırlanan. veya 1.2.4.) ve (adım 1. 3'hazır.) RBCs, kauçuk tıpa ile kapalı bir polipropilen şişe içine istenilen hematokrit. Örneğin, % 20 hematokrit RBCs 200 µL PRP 800 µL için ekleyin.
   Not: Hematocrits % 0 önerilir % 40. Trombosit cam yüzey için uygun bir cam şişe veya balon kullanmayın.
2. Helyum gaz tankı için kapalı şişe içine bağlı iğne takın ve gaz çıkış 26 G iğne (Şekil 1) ekleyerek olursunuz.
3. Yavaş yavaş, oda sıcaklığında şişe girdap.
   Not: O gaz kalibre edilir kabarcık izin vermez. Yavaş gaz akışı Bu yordam için tercih edilir ve aşırı hızlı o gaz akışı için artan hemoliz yol açar. Son derece deneysel Kur geometri üzerinde bağlı olarak deneme tarafından belirlenecek en verimli gaz akışı gerekir.
4. Düzenli olarak bir eş oksimetre kullanarak kısmi oksijen basıncı (pO₂) ölçerek deoxygenation süreci izler.
   Not: Bizim ellerimizde 10 dk deoxygenation azalır pO₂ için nitrit azaltma tarafından RBCs. deoxygenation devam gerekli olan 25 mmHg daha fazla 10 mmHg pO₂ azaltmak yaptı; Ancak, bu artan hemoliz ve boş hücre hemoglobin (Şekil 2) artışlara yol açtı.

3. kırmızı kan hücresi nitrit azaltma

1. PBS (pH 7,4) 1 mL NaNO₂ 500 mM hisse senedi çözümü nitrit yapmak 0.0345 g içine ekleyin. 500 mM NaNO₂ 250 µM NaNO₂ (25 x) tarafından seri seyreltme PBS (pH 7,4) oranında seyreltin.
2. Bir microsyringe kullanarak, nitrit (40 µL) septum son toplam 1 ml örnek 10 µM konsantrasyonları elde etmek için PRP ve RBCs deoxygenated örneği içine enjekte et.
   Not: Bu deneyde kullanılan nitrit son konsantrasyonları 10 µM var.
3. Örnek 37 ° C'de 10 dakika veya daha uzun kuluçkaya.
   Not: Farklı tür deneyler için maksimal nitrit azaltılması için gerekli nitrit ile RBC kuluçka tam süresini ayarlayın.
4. Tıpa ve pipet 1 mL örnek bir microcentrifuge tüpüne kaldırın.
5. Vasıl 200 x g oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
6. 300 µL trombosit süspansiyon üst bölümünden süpernatant pipet ve bir 1:9 oranı ACD (pH 6,5) ile karıştırın. RBC Pelet atmak.
7. Trombosit süspansiyon vasıl 500 x g için oda sıcaklığında 4 dk santrifüj kapasitesi.
8. Buz gibi lizis arabelleği (150 mM NaCl, 50 mM Tris, %0,5 NP-40, pH 7,4) 80 µL eklemek proteaz inhibitörü içeren kokteyl III (1:500) trombosit unsurlardandır.

4. Batı VASP kurutma

1. Her örnek protein 2 ayrı % 10 SDS-sayfa jeller için yük 15 µg.
   Not: B-mercaptoethanol içerir, sert sıyırma arabellek P-VASP^Ser239 ve VASP antikorları membran kaldıramazsınız; Bu nedenle, P-VASP ^Ser239 ve VASP ayrı ayrı çalıştırılması gerekir.
2. Jelleri 120 V 1,30 h ve transferi nitroselüloz membran için çalıştırın.
3. Blok non-spesifik bağlama %5 yağsız Kuru süt ile.
4. Gecede 4 ° C'de için P-VASP^Ser239 (1:500), VASP (1:1, 000) ve GAPDH (1:1, 000) ile membran kuluçkaya
5. 45 dakika oda sıcaklığında membran ile horseradish peroksidaz (HRP) ikincil antikor kuluçkaya.
6. Membran Imager makine ile açığa ve ImageJ kullanarak bant yoğunluğunu ölçmek.

Sonuçlar

PO₂ değerleri arasında 50-80 mmHg venöz kan örnekleri var. Deoxygenation helyum tarafından hızla pO₂ 10 en az artan deoxygenation zaman biraz daha fazla düşüşler pO₂içinde 25 mmHg olarak azalır. Ancak, deoxygenation artan zaman da boş hücre hemoglobin (görsel olarak plazma giderek kırmızı rengi Şekil 2 ' de görülen ortak oksimetre tarafından belirlenen) önemli ölçüde yüksek düzeyde yol açar (

Tartışmalar

Trombosit kolayca etkinleştirilir beri trombosit içeren işlenmesi nazik örnekleri gereklidir. Hızlı pipetting ve güçlü sallayarak kaçınılmalıdır. Trombosit inhibitörleri gibi prostacyclin (PGI₂) trombosit aktivasyon önlemek için kullanılabilir; Ancak, bu bazı sinyal yolları içinde trombosit etkileyebilir. Trombosit granül kursları, ACD trombosit süspansiyonlar ekleyebilir ve düşük hızlı Santrifüjü kullanabilirsiniz.

Taze hazırlanmış trombositlerin P...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-sodium citrate	Supply by NIH blood bank
Citric acid	Supply by NIH blood bank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; sodium chloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; potassium chloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; sodium bicarbonate	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calcium chloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles	Nalgene	2089-0001
Red septum stopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; sodium nitrite	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody	Cell signaling technology	3114
VASP antibody	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer