البلعمه البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا في الفئران

Summary

هنا نحن تقرير الأساليب الشائعة لتحليل الدالة متجولة مورين البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا من الرئة. دراسة هذه الأساليب البلعمه في المختبر من fluorescein isothiocyanate الخرز والمجراه في البلعمه من "بروتين فلوري أخضر" الزائفة الزّنجاريّة . كما يصف لنا طريقة لمسح P. الزّنجاريّة في الفئران.

Abstract

البلاعم السنخية (هيئة علماء المسلمين) حراسة الفضاء التهاب في الرئة. البلعمه بمقياس الدعم الكلي تلعب دوراً حاسما في الدفاع ضد غزو العوامل الممرضة، وإزالة الخلايا الميتة أو الجسيمات الأجنبية، وفي القرار الردود الملتهبة والأنسجة يعيد البناء، العمليات التي هي توسط المستقبلات السطحية المختلفة من هيئة علماء المسلمين. هنا، نحن التقرير أساليب لتحليل الدالة متجولة لمقياس الدعم الكلي باستخدام استراتيجيات تجريبية وفحوصات في المختبر والمجراه في التفريق بين نمط الاعتراف مستقبلات-وتكملة مستقبلات-، ونادي غاما بوساطة مستقبلات البلعمه. وأخيراً، نحن نناقش أسلوب لإنشاء ووصف نموذج P. الزّنجاريّة الالتهاب رئوي في الفئران لإزالة البكتيريا الحية في تقييم. هذه الاختبارات تمثل الأساليب الأكثر شيوعاً لتقييم وظائف صباحا ويمكن استخدامها أيضا لدراسة وظيفة بلعم وإزالة البكتيريا في الأجهزة الأخرى.

Introduction

هيئة علماء المسلمين هي البالعات المقيم الرئيسي في الحويصلات الهوائية في مرحلة استراحة وواحدة من اللاعبين الرئيسيين من الاستجابات المناعية الفطرية من خلال الاعتراف واستيعاب استنشاق الجراثيم والجسيمات الأجنبية^1،2. وذكر أن هيئة علماء المسلمين تعتبر أساسية للتخليص السريع من العديد من مسببات الأمراض الرئوية مثل P. الزّنجاريّة و الالتهاب الرئوي الكلبسيله^3،4، حيث غالباً ما يؤدي نقص في البلعمه صباحا في الجهاز التنفسي التهابات، مثل الالتهاب الرئوي الحاد، مما يتسبب في ارتفاع معدلات الوفيات والاعتلال.

هيئة علماء المسلمين أيضا بدء الفطرية الردود التهاب في الرئة بإنتاج السيتوكينات والمستقطبات مثل تنف-α وايل-1β، الذي الحديث المتبادل مع الخلايا الأخرى للبيئة السنخية لإنتاج المستقطبات وتجنيد العَدلات التحريضية، وحيدات، و الخلايا المناعية التكيفية في الرئة⁵. على سبيل المثال، يساعد إيل-1β التي تنتجها هيئة علماء المسلمين رئيس الوزراء إطلاق سراح chemokine العَدلات CXCL8 من الخلايا الظهارية⁶. وعلاوة على ذلك، تسهم هيئة علماء المسلمين البلعمه من الكريات البيض النوى apoptotic (بمنس)، فشل الأمر الذي يؤدي إلى تسرب المطرد للإنزيمات داخل الخلايا من بمنس إلى الأنسجة المحيطة مما أدى إلى تلف الأنسجة والتهاب المطول ^{7 , 8 , 9}.

هو باعتراف مباشر بأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة في السطح الممرض المستقبلات التعرف على نمط (برس) من هيئة علماء المسلمين أو بواسطة الربط من مسببات الأمراض أوبسونيزيد مع مستقبلات المستجيب محصنة من هيئة علماء المسلمين وساطة البلعمه بهيئة علماء المسلمين ¹⁰-لهذا الأخير، مقياس الدعم الكلي يمكن التعرف على الأهداف التي أوبسونيزيد مع الغلوبولين المناعي (IgG) من خلال ما مستقبلات Fcγ (FcγR) أو مسببات الأمراض مغلفة بشظايا مكملاً، C3b و C3bi، من خلال مستقبلات تكمل بهم (CR)¹¹. بين مستقبلات مكملاً، وأعرب عن الجمهورية التشيكية من فوق عائلة الغلوبولين المناعي (كريج) بشكل انتقائي في الأنسجة الضامة¹²، ونتيجة الأخيرة وأبرزت دور كريج في البلعمه صباحا في سياق P. الزّنجاريّة الالتهاب الرئوي ¹³.

العديد من الدراسات الأصلية استخدام أساليب تقييم بلعم البلعمه لوصف الآليات الجزيئية بلعم الدالة^14،15. ومع ذلك، تتطلب أساليب مثل البلعمه المجراة في إجراء تقييم كمي دقيق البلعمه. وهنا، يمكننا تلخيص منهجية مفصلة البلعمه على حد سواء في المختبر والمجراه في استخدام fluorescein isothiocyanate (فيتك)-الزجاج الخرز والبروتين P. الزّنجاريّة أخضر نيون (التجارة والنقل)، على التوالي. علاوة على ذلك، يشرح لنا الطريقة للتفريق بين بر-والجمهورية التشيكية--و FcγR بوساطة البلعمه. وأخيراً، نحن تقرير طريقة تميز إزالة البكتيرية في الماوس فيما يتعلق بالتهاب رئوي P. الزّنجاريّة .

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية.

1. فلوري الخرز البلعمه

1. Euthanize الماوس (C57BL/6J، 6 أسابيع من العمر، أنثى) CO₂ خنقاً وفقا لبروتوكولات IACUC للقتل الرحيم الأخلاقية للحيوانات ب.
2. وضع الفأرة أعلى البطن على لوحة تشريح مغطاة بالمناشف الورقية. دبوس الكفوف باستمرار مع أطرافه في سبريديجلي وربط سلسلة تحت الأسنان الأمامية لسحب رأسه إلى الوراء حيث أن القصبة الهوائية هي في وضع مستقيم ومستوى.
3. ويت الحلق والصدر والبطن مع الإيثانول 70% لتطهير ومنع الفراء من التمسك الأدوات الماوس.
4. استخدام الملقط العادية، سحب ما يصل إلى الجلد في خط الوسط للجسم، وقطع بالمقص الجراحي تصل خط الوسط إلى الجزء العلوي من الحلق.
5. استخدام نهاية حادة مقص جراحي القياسية، بعناية الابتعاد بالعضلات والأنسجة الضامة في الحلق واستخدام مقص الربيع (ميكروسسيسورس) لفضح القصبة الهوائية.
6. تجتاح عصابة غضروف مع الملقط، بعناية إجراء شق صغير (~1.5 ملم)، باستخدام ميكروسسيسورس، في مواجهة بطين من القصبة الهوائية وإدراج قنية ز 18 في القصبة الهوائية.
7. الغسل بلطف 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1 مل في وقت واحد. في كل مرة بلطف سحب السائل في المحاقن ورينفوسي مرة أخرى في الرئة، س 3 على التوالي. وبعد جمع بالف، أداء التفكك عنق الرحم التأكد من القتل الرحيم. نقل برنامج تلفزيوني المجمعة (مل ~2.8)، وسائل الغسل للفيسيولوجيا (بالف)، إلى أنبوب الطرد المركزي في غ س 1,000 لمدة 10 دقائق، وجمع بيليه. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد للأنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقيقة ليغسل الأنقاض وجمع الضامة السنخية الأعلاف.
8. ريسوسبيند بيليه في 2 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 10% معطل nonheat الجنيني البقري المصل (FBS) وثقافة الضامة السنخية الأولية في نفس الوسائط لمدة يومين على طبق زجاج لأسفل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد.
9. نضح وسائط الإعلام القديمة وغسله مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل وسائط جديدة. إضافة الخرز فيتك (كاربوكسيلاتيد مطاط الخرز، 2 ميكرومتر في القطر، والخرز 50/خلية) واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد.
10. أغسل على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (1 مل في وقت، لما مجموعة خمسة يغسل) لإزالة حبات خارج الخلية. صورة الخلايا 100 عشوائياً وحساب الخلايا مع الخرز داخل الخلايا (488 نانومتر).
    ملاحظة: فهارس Phagocytic هي عدد حبات بلعها مقسوماً على العدد الكلي الضامة؛ النسبة المئوية للخلايا البلعمية هو عدد الضامة الذي يبتلع حبة واحدة على الأقل مقسوماً على العدد الكلي الضامة¹⁶.
    1. وبدلاً من ذلك، بعد حضانة ح 1 مع الخرز، تغسل الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني وعملية لهم للتدفق الخلوي للتحديد الكمي البلعمه. وبالمثل، عملية هيئة علماء المسلمين دون الخرز كخلايا أونستاينيد أو خلايا عنصر التحكم. حساب الإيجابية النسبة المئوية ويعني كثافة الأسفار، واستخدام البرمجيات التدفق الخلوي، بتحديد هذه الخيارات في البرنامج.

2-البلعمه FcγR والجمهورية التشيكية-بوساطة

1. ل opsonization، احتضان 2 x 10⁸ الأغنام خلايا الدم الحمراء (سربكس) مع 50 ميليلتر من الأرانب المضادة-مخمدة-IgM أو 50 ميليلتر من الأرانب المضادة-مخمدة-مفتش لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة¹¹.
2. احتضان سربكس أوبسونيزيد IgM مع 50 ميليلتر من المصل الإنسان تفتقر إلى C5 (C5D) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإصلاح أجزاء مكملة C3b و C3bi على سربكس المغلفة IgM.
3. البذور بلعم مورين الخلايا (خلايا MH-S) (10,000 الخلايا أيضا) في لوحة 96-جيدا واحتضان بين عشية وضحاها الحصول على التقاء ~ 70%. إضافة 100 ميليلتر من/mL 1 × 10⁷أوبسونيزيد سربكس لكل بئر من الخلايا MH-S واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. المياه والصرف الصحي غير منضم سربكس بسرعة كبيرة (~ 1 دقيقة) مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم (ACK).
4. الخلايا مع الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% وإضافة 50 ميليلتر من 2, 7-ديامينوفلوريني (DAF) التي تحتوي على 3% بيروكسيد الهيدروجين واليوريا م 6. قياس امتصاص لتشكيل الهيموغلوبين حفزت فلوريني الأزرق في 620 نانومتر.
5. تحديد عدد سربكس باستخدام منحنى قياسي في شمال البحر الأبيض المتوسط 620 امتصاص القيم مع عدد معروف من سربكس. وبالمثل، المحتضنة الخلايا عملية MH-S مع سربكس نونوبسونيزيد لاستخدامها كعناصر سلبية.

3-بوساطة بر البلعمه

1. اتبع الخطوات 1.1-1.9 للعزلة واستزراع للماوس البلاعم السنخية الأولية.
2. بعد يومين، قم بإزالة الوسائط وتغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 500 ميليلتر الطازجة الوسائط التي تحتوي على فلور أليكسا-488-مترافق بيوبارتيكليس زيموسان-أ (100 الجسيمات في الطبق).
3. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. تتوقف البلعمه بإضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج.
4. تغسل الخلايا على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (1 مل في وقت، لما مجموعة خمسة يغسل). إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. تغسل الخلايا على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (1 مل في وقت، لما مجموعة خمسة يغسل) وإبقاء الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
6. صورة الخلايا تحت التباين التدخل التفاضلية وقناة فلورسنت في 488 نانومتر. حساب مقياس الدعم الكلي التي تحتوي على بيوبارتيكليس زيموسان-أ وتحديد النسبة مئوية البلعمه.

4. في فيفو البلعمه البلاعم السنخية

ملاحظة: تطعيم P. الزّنجاريّة بروتينات فلورية خضراء على طبق أجار مغذيات واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تطعيم مستعمرة واحدة إلى 2 مل مرق المغذيات وتنمو البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

1. وفي اليوم التالي تخدير الفئران مع إدارة داخل xylazine الكيتامين و 10 مغ/كغ 100 مغ/كغ. تأكيد أنيسثيتيزيشن السليم عن طريق عدم الاستجابة إلى رشة أخمص القدمين.
2. وضع الماوس على لوحة مسطحة مع شريط المطاطي عبر القواطع العلوية ووضعه في موقف سيميريكومبينت (45°) مع السطح البطني والمنصة التي تواجه التصاعدي. استخدام الملقط المنحنية، جزئيا بسحب اللسان. استخدام ميكروسبرايير، إينتراتراتشيلي إدارة 50 ميليلتر (5 × 10⁶ مستعمرة تشكيل وحدات [زيمبابوي])¹⁷ من P. الزّنجاريّة بروتينات فلورية خضراء في رئات الفئران أنيسثيتيزيد.
3. بعد 1 ساعة إصابة، اتبع الخطوات 1، 1، 1-7.
4. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني وسيتوسينتريفوجي لهم (1,000 س ز، 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) إلى شريحة زجاج.
5. خلطات وصمة عار الشرائح سيتوسبين البلاعم السنخية والعدلات واللمفاويات، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
6. حدد مقياس الدعم الكلي 100 عشوائياً، حساب مقياس الدعم الكلي التي تحتوي على البكتيريا داخل الخلايا، وتحديد النسبة مئوية البلعمه.

5. في فيفو "استخدام إزالة البكتيريا" P. الزّنجاريّة

1. تطعيم P. الزّنجاريّة على طبق أجار عزلة P. الزّنجاريّة واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تطعيم مستعمرة واحدة إلى 2 مل مرق ليسوجيني (رطل) وتنمو البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. حساب زيمبابوي، باستخدام الصيغة التالية.
   
   زيمبابوي/مل = (عدد المستعمرات × معامل التخفيف)/حجم لوحة الثقافة.
   
   تمييع الثقافة مع برنامج تلفزيوني للحصول على المطلوب زيمبابوي/مل.
2. في المحاكمة الأولى، إينتراتراتشيلي بحقن جرعة ~2.5 x 10⁵ مليلتر زيمبابوي P. الزّنجاريّة المقاسة تخديره البرية من نوع (WT) و TRIM72^كو الفئران، كما ذكر في الخطوة 4، 2. قياس وزن الجسم يوميا لمدة 6 أيام.
3. في 2 المحاكمة، حقن جرعة ثانية من P. الزّنجاريّة (5 × 10⁵ زيمبابوي/mL) في الفئران التي نجت في 1 المحاكمة وقياس وزن الجسم لمدة 4 أيام.
4. وفي 3 للمحاكمة، باستخدام مجموعة مختلفة من الفئران، حقن الفئران^كو WT و TRIM72 بجرعة قاتلة (3 × 10⁷ زيمبابوي/mL) من P. الزّنجاريّة وتسجيل الوفيات خلال يومين حقن. سيتم تقييم الحيوانات تظهر علامات الإجهاد الشديد مثل هيئة هامة لتخفيف الوزن، متحدب مرة أخرى، وفقدان الشهية، أو ضيق التنفس من الأطباء البيطريين الذين حضروا. سيتم التضحية بالحيوانات غير قابل للعلاج فورا.
5. أما في القتل أو بعد القتل الرحيم في اليوم الثاني بعد الحقن، جمع أنسجة الرئة الجامع للتحديد الكمي لعبء الرئة البكتيري في ذروة الإصابة.
6. لاختبار عبء الرئة البكتيري وإضافة 200 ميليلتر من المحلول الملحي العادي إلى أنسجة الرئة وتجانسه، استخدام أحد إعدادات مجربة سابقا في الخالطون إلكترونية أن يعطل تماما أنسجة الرئة دون كسر البكتيريا. ضبط الحجم الإجمالي هوموجيناتي الرئة إلى ميليلتر 100 مل 1 ولوحة الرئة على ألواح أجار العزلة Pseudomonas في تخفيف المسلسل إذ.
7. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 24 وعدد المستعمرات البكتيرية لتحديد زيمبابوي في الرئة كاملة.

6. التحليل الإحصائي

1. استخدام الطالب t-اختبار لتحديد الدلالة الإحصائية للفرق بين المجموعتين. تنظر فرق يعتد به إحصائيا عند 0.05 < p . يتم عرض كافة البيانات يعني ± الخطأ المعياري للوسط (SEM).

النتائج

أجرينا أول تجربة لتحليل البلعمه بالماوس مقياس الدعم الكلي الأساسي. طوال جميع التحليلات، قارنا AMs المعزولة من الفئران WT و TRIM72^كو . كما هو مبين في الشكل 1ألف، كشف الفحص المجهري الأسفار أن البلعمه من حبات الزجاج فيتك بالماوس مقياس الدعم الكلي ا?...

Discussion

بينما تؤدي وظيفة تبادل غازات، يواجه الرئة إصرار الجسيمات الأجنبية ومسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية. مقياس الدعم الكلي توفر الخط الأول للدفاع بحكم وظيفتها الرئيسية، إلا وهي البلعمه. هيئة علماء المسلمين أيضا بتنسيق مع سائر الخلايا المناعية في تدمير مسببات الأمراض، وفي القرار من ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade