肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

要約

ここでマウス肺胞マクロファージおよび肺から細菌クリアランスの貪食能を分析するための一般的な方法を報告します。これらのメソッドは、フルオレセイン イソチオ シアン酸ビーズの貪食および緑膿菌緑色蛍光タンパク質の生体内で貪食能を検討します。マウスで膿をクリアするための方法について述べる。

要約

肺胞マクロファージ (AMs) は、肺の肺胞腔をガードします。AMs によって貪食病原体、死んだ細胞や異物の除去に侵入戦防衛で重要な役割を果たしている、炎症反応、組織改造の解像度では、処理の様々 な表面の受容器によって仲介されます。AMs。ここで、in vitro および in vivo アッセイおよび実験的戦略を使用してパターン認識受容体-、補体受容体 - と受容体を介した Fc ガンマを区別する AMs の貪食能の分析方法を報告します。貪食。最後に、我々 は確立し体内細菌クリアランスを評価するためにマウスで膿性肺炎モデルを特徴付ける方法をについて説明します。これらの試金は午前の機能を評価する最も一般的な方法を表し、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます。

概要

AMs は、休止期、1 つ認識を介して免疫反応の主要なプレーヤーと吸入の病原体や異物^1,2の内面化、肺胞で主要な居住者食です。午前貪食の欠乏はしばしば呼吸の結果、AMs が膿やクレブシエラ肺炎^3,4など多くの肺病原体の迅速なクリアランスに欠かせないことが報告されています。などの感染症、急性肺炎死亡率と罹患率を引き起こす。

AMs は、サイトカインやケモカイン TNF α、il-1、ケモカインを生成し、炎症性好中球、単球を集める歯槽の環境の他の細胞のクロストークなどを生産することによって肺で生得的な炎症反応を開始するも、肺⁵適応免疫細胞。たとえば、AMs によって生成される il-1 は主要な上皮細胞⁶から好中球ケモカイン CXCL8 のリリースに役立ちます。また、AMs はアポトーシス多形核白血球 (Pmn) の貪食能、周囲の組織、組織の損傷の結果、長期の炎症細胞内酵素の持続的な漏出につながる Pmn からの失敗に貢献します。^7,8,9。

AMs が貪食は、AMs のパターン認識受容器 (PRRs)、オプソニン病原体の AMs の免疫エフェクター受容体との結合による病原体の表面に病原体関連分子パターンの直接認識によって媒介されます。¹⁰します。 後者の AMs は、Fcγ 受容体 (FcγR) で免疫グロブリン (IgG) とオプソニン ターゲットを認識できるまたは補体の断片、C3b と発見及び C3bi、補体受容体を介して病原体被覆 (CR)¹¹。補体受容体の中で免疫グロブリン スーパーファミリー (CRIg) の CR は組織マクロファージ¹²で選択的に発現し、最近の知見膿肺炎のコンテキストで午前食から CRIg の役割を強調表示¹³。

元の多くの研究は、マクロファージ機能^14,15の分子メカニズムを記述するのにマクロファージ貪食能を評価するのにメソッドを使用します。しかし、生体内で貪食能のようなメソッドは、貪食の正確な定量を必要です。ここで、かに (FITC) を使用して生体外でそして生体内で貪食能の詳細な方法については要約-ガラス ビーズと膿緑色蛍光タンパク質 (GFP)、それぞれ。さらに、PRR、CR、および FcγR を介した細胞貪食の間で区別する方法をについて説明します。最後に、P.緑膿菌肺炎に関してマウスにおける細菌クリアランスをキャラクタライズ手法を報告する.

プロトコル

このプロトコルの制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 東バージニア医学校のガイドラインに従います。

1. 蛍光ビーズ貪食

1. マウスを安楽死させる (c57bl/6 j、6 週齢、女性) 動物の倫理的な安楽死のため IACUC プロトコルに従って CO₂窒息により。
2. ペーパー タオルで覆われて解剖基板上腹のマウスを置きます。その手足をイナバウアーで前足をダウンピンし、その気管がまっすぐ配置されて、戻ってくる、その頭をプルする前に歯とレベル下で文字列をフックします。
3. マウスの喉、胸、腹を 70% エタノール消毒や毛皮がツールにくっつかないように濡れています。
4. 定期的な鉗子を使用すると、体の中心線で皮膚を引き上げ、喉の上に中心線を手術用はさみでカットします。
5. 標準的な外科はさみの鈍い端を使用して、慎重に喉の筋肉や結合組織を離れ、春はさみ (刀) を使用して、気管を公開します。
6. 軟骨輪を鉗子で把持、慎重に気管の心室の顔に、刀を用いた小切開 (~1.5 mm) を行い 18 G カニューレを気管に挿入します。
7. 優しく洗浄リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、一度に 1 mL を 3 mL。たびには優しく注射器と肺に reinfuse に、羊水を抜き取る連続 3 x。BALF を収集した後、安楽死できるように頚部転位を実行します。1,000 x g で 10 分間遠心チューブに気管支肺胞洗浄液 (BALF) で、収集された PBS (~2.8 mL) を転送し、ペレットを収集します。チューブと破片を洗浄し、ペレットの肺胞マクロファージを収集 10 分 1,000 x gで遠心分離機に新鮮な PBS の 1 mL を追加します。
8. 加湿雰囲気で 37 ° C でガラス底皿の上 2 日間ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 特性不活化ウシ胎児血清 (FBS) と同じメディアの文化主な肺胞マクロファージの 2 mL にペレットを再懸濁します。
9. 古いメディアを吸引、1 mL の PBS で洗浄し、新鮮なメディアの 2 mL を追加します。FITC ビーズ (ミクロス ラテックス ビーズ、直径 2 μ m、50 ビーズ/セル) を追加し、加湿雰囲気で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
10. 細胞ビーズを削除する PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲を洗浄します。100 セルをランダムに画像し、細胞内のビーズでセルをカウント (488 nm)。
    注: 貪食能インデックスは、マクロファージの数の合計で割った値摂取のビーズの数貪食細胞の割合は、マクロファージの¹⁶の合計数で割った値が少なくとも 1 つのビードを摂取するマクロファージの数です。
    1. また、ビーズで 1 時間培養後 3 ml の PBS のセルを洗浄して、処理する貪食能の定量化のためのフローサイトメトリー用。同様に、無染色の細胞または制御の細胞としてビーズしないで AMs を処理します。割合陽性を計算し、ソフトウェアでこれらのオプションを選択することによって流れ cytometry ソフトウェアを使用して蛍光強度を意味します。

2 媒介 FcγR と CR の貪食。

1. オプソニン、ウサギ抗 SRBC IgM の 50 μ L または室温¹¹時 30 分の抗 SRBC IgG ウサギの 50 μ L を 2 × 10⁸羊赤血球 (SRBCs) を孵化させなさい。
2. 37 ° C で 30 分間 C5 欠損 (C5D) ひと血清の 50 μ L で IgM コーティング SRBCs 上の C3b と発見及び C3bi 補体の断片を修正する SRBCs を IgM オプソニンを孵化させなさい。
3. マウスのマクロファージ細胞 (MH S 細胞) を種子 (10,000 細胞/ウェル) 96 ウェル プレートで 〜 70% の合流点を得るために一晩を孵化させなさいと。MH S セルの各ウェルに SRBCs をオプソニン 1 x 10⁷/mL の 100 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート洗浄は非常に迅速に SRBCs を非連結 (~ 1 分) アンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーの 100 μ L で。
4. 0.1 %sds の細胞を溶解し、50 μ L 2, 7-diaminofluorene (DAF) 3% 過酸化水素と 6 M 尿素を含むを追加します。620 でヘモグロビン触媒フルオレン系青色層の吸光度を測定 nm。
5. SRBCs の知られている数と 620 nm の吸光度値に標準曲線を使用して、SRBCs の数を決定します。同様に、プロセス MH S 細胞リセプター SRBCs ネガティブ コントロールとして使用すると孵化します。

3. PRR を介した貪食

1. 手順 1.1 1.9 分離、マウス プライマリ肺胞マクロファージの培養するために従います。
2. 2 日後に、メディアを取り出し、1 ml の PBS のセルを洗浄して Alexa Fluor 488 共役ザイモザン A バクテリア (100 粒子/料理) を含む新鮮なメディアを 500 μ l 添加します。
3. 37 ° C で 1 時間インキュベートします。500 μ L の氷冷 PBS の追加によって貪食を停止します。
4. PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲のセルを洗浄します。室温で 10 分間 4% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。
5. PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲のセルを洗浄して、500 μ L の PBS で細胞を保ちます。
6. 微分干渉コントラストと 488 で蛍光チャネルの下のセルを画像 nm。ザイモザン A バクテリアを含む AMs をカウントし、貪食の割合を決定します。

4.生体内で肺胞マクロファージによる貪食

注: 寒天プレートに膿GFP を接種して、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の日に 2 mL 栄養流体培養基に単一のコロニーを接種して 37 ° C でバクテリアを一晩。

1. 次の日は、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与によるマウスを麻酔します。つま先のピンチに反応の欠如によって適切な anesthetization を確認します。
2. 上顎前歯部にゴムバンドで平らな板にマウスを置くし、腹側表面と上向き演壇 semirecumbent (45 °) の位置に配置します。鉗子を使用して、部分的に舌を引っ込めます。気管内投与管理、50 μ L (5 x 10⁶コロニー形成単位 [CFU])¹⁷ 膿GFP の麻酔下のマウスの肺に、microsprayer を使用して、します。
3. 後感染の 1 h は、1.1 から 1.7 の手順に従います。
4. PBS および収集に細胞を再懸濁しますスライド ガラスにそれら (1,000 × g室温で 1 分)。
5. 製造元の指示に従って肺胞マクロファージ、好中球とリンパ球の cytospin スライドを特異的染色します。
6. ランダムに 100 の AMs を選択、細胞内の細菌を含む AMs をカウント、貪食の割合を決定します。

5.体内細菌クリアランスを使用して膿

1. 膿分離寒天プレートの膿を接種し、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。ホストゲノム スープ (LB) 2 mL に単一のコロニーを接種し、37 ° C でバクテリアを一晩。次の数式を使用して、CFU を計算します。
   
   CFU/mL = (x の希釈倍率のコロニーの数)/培養プレートのボリューム。
   
   必要な CFU/mL を取得する PBS の文化を希釈します。
2. トライアル 1 気管内注入 ~2.5 x 10⁵ CFU/mL膿の致死線量麻酔下の野生型 (WT) と TRIM72^KOマウス、4.2 の手順に記載されているようです。6 日間、毎日体重を測定します。
3. トライアル 2 で試用 1 で生き残ったし、4 日間の体重を測定するマウスに膿(5 x 10⁵ CFU/mL) の 2 回目を挿入します。
4. マウスの異なるセットを使用して、試用版の 3 で膿の致死量 (3 x 10⁷ CFU/mL) の WT と TRIM72 の^KOマウスを注入し、注入の 2 日以内死亡率を記録します。動物は、有意な体重減少などの重度のストレスの兆しを見せて、呼吸困難や食欲不振、背を丸めてバック参加獣医によって評価されます。すぐに治療不可能な動物が犠牲になります。
5. 死または注射後 2 日目で安楽死した後、ピーク感染で肺の細菌負荷の定量化のため肺全体を収集します。
6. 肺の細菌負荷をテストするためには、肺組織に生理食塩水入りの 200 μ L を追加し、完全に細菌を壊すことがなく肺組織を混乱させる電子のホモジナイザーで以前にテストした設定を使用して、それらを均質化します。肺の 10 倍のシリアル希薄で緑膿菌分離寒天の溶解液の 1 mL とプレート 100 μ L に肺ホモジネートの総量を調整します。
7. 24 h の 37 ° C で版を孵化させなさいそして全肺あたり CFU を決定する細菌のコロニーをカウントします。

6. 統計解析

1. 学生のtを使用して、-2 つのグループ間の差の統計的有意性を調べるテスト。とき統計的に有意な違いを考慮するp < 0.05。(SEM) 平均値 ± 標準誤差を手段として、すべてのデータが掲載されています。

結果

まずマウスで貪食能を分析する実験を行った主な AMs。すべての解析を通して WT ・ TRIM72^KOマウスから分離した AMs を比較しました。図 1Aのように、蛍光顕微鏡プライマリ AMs 発生 1 時間後のマウスで FITC ガラスビーズの貪食能を明らかにしました。図 1Bは、フローサイトメトリーによる貪食?...

ディスカッション

ガス交換機能を実行している間肺永続的異物、病原体、およびアレルゲンを直面しています。AMs は、主な機能、すなわち貪食のおかげで防衛の最初の行を提供します。AMs はまた他の免疫細胞が病原体を破壊して炎症の解像度を調整します。ここでは、具体的にはマウス肺から分離された AMs によって貪食能を評価する方法について述べる。本稿で提示されたプロトコルは、マクロファージの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade