מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

Summary

כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.

Abstract

עיצור מכתשי, מקרופאגים (AMs) השומרים את החלל מכתשי של הריאה. Phagocytosis מאת AMs משחק תפקיד קריטי בהגנה נגד הפולשים פתוגנים, הסרת תאים מתים או חלקיקים זרים, ומעבד בהחלטה תגובות דלקתיות ושחזור רקמות, מתווכת על ידי רצפטורים משטח שונים של AMs. כאן, אנחנו מדווחים שיטות לניתוח של הפונקציה phagocytic של AMs באמצעות מבחני במבחנה, ויוו ואסטרטגיות ניסיוני כדי להבדיל בין דפוס זיהוי הקולטן-, המשלים קולטן-Fc גמא קולטן בתיווך phagocytosis. לבסוף, נדון שיטה ליצירה ולקביעת לאפיין את מודל דלקת ריאות aeruginosa פ בעכברים כדי להעריך ויוו חיידקי סיווג. מבחני אלה מייצגים את השיטות הנפוצות להערכת AM פונקציות, יכול לשמש גם ללמוד מקרופאג פונקציה ו סיווג חיידקי באיברים אחרים.

Introduction

AMs הינם phagocytes תושב הגדולות ב alveoli השלב מנוחתו, אחד השחקנים הראשיים של תגובות מערכת החיסון המולדת דרך ההכרה, הפנמה של פתוגנים בשאיפה וחלקיקים זרים^1,2. בעבר דווח כי AMs הם חיוניים עבור פינוי מהיר של פתוגנים ריאתי רבים כגון aeruginosa פ ודלקת ריאות קלבסיאלה^3,4, אז חוסר AM phagocytosis לעתים קרובות התוצאות הנשימה זיהומים, כגון דלקת ריאות חריפה, הגורמים שיעור גבוה של תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית.

AMs גם ליזום תגובות דלקתיות מולדת בריאה על ידי ייצור ציטוקינים ו נוגדנים כגון TNF-α ו- IL-1β, אשר crosstalk עם תאים אחרים של הסביבה מכתשי לייצר נוגדנים, לגייס נויטרופילים דלקתיות, ומונוציטים, ו תאים חיסוניים מסתגלת ב- ריאות⁵. לדוגמה, IL-1β המיוצר על ידי AMs מסייעת פריים לשחרור נויטרופילים כימוקין CXCL8 לתאי האפיתל⁶. יתר על כן, AMs לתרום phagocytosis אפופטוטיים להיפגע אורך חייהם יצירת לויקוציטים (PMNs), כשל של כשבסופו לדליפת מתמשכת של אנזימים תאיים מ PMNs הרקמה שמסביב, והתוצאה היא נזק לרקמות, דלקת ממושכת ^{7 , 8 , 9}.

Phagocytosis מאת AMs מתווך על ידי הכרה ישירה של פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית על פני השטח הפתוגן קולטני זיהוי דפוס (PRRs) של AMs או על ידי האיגוד של פתוגנים opsonized עם אפקטור החיסון רצפטורים של AMs ¹⁰. עבור האחרון, AMs יכול לזהות את המטרות opsonized עם אימונוגלובולינים (IgG) דרך רצפטורים Fcγ שלהם (FcγR) או פתוגנים מצופה המשלים שברים, C3b, C3bi, דרך רצפטורים המשלים שלהם (CR)¹¹. בין רצפטורים המשלים, הכי טובים ביותר של superfamily אימונוגלובולינים (CRIg) מתבטאת באופן סלקטיבי רקמות מקרופאגים¹², והדגשתי ממצא האחרונות בתפקיד CRIg ב AM phagocytosis בהקשר של דלקת ריאות aeruginosa פ ¹³.

מחקרים מקוריים רבים להשתמש בשיטות להעריך מקרופאג phagocytosis כדי לתאר את המנגנונים המולקולריים של מקרופאג פונקציה^14,15. עם זאת, שיטות כמו phagocytosis ויוו לדרוש כימות מדויק של phagocytosis. כאן, אנו מסכמים מתודולוגיה מפורט phagocytosis ויוו והן במבחנה באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-זכוכית חרוזים, חלבון פלואורסצנטי aeruginosa פ ירוק (GFP), בהתאמה. עוד, נסביר את שיטת המבדילים בין PRR - CR-, בתיווך FcγR phagocytosis. בסופו של דבר, אנחנו מדווחים על שיטה לאפיון סיווג חיידקי עכבר ביחס פ aeruginosa דלקת ריאות.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של הספר לרפואה במזרח וירג'יניה.

1. פלורסנט חרוזים Phagocytosis

1. המתת חסד העכבר (C57BL/6J, בן, 6 שבועות נקבה) על ידי חנק₂ CO לפי IACUC פרוטוקולים עבור המתת החסד האתית של בעלי חיים.
2. הנח העכבר הפאזלים על קרש חיתוך מכוסה מגבות נייר. לרתק כפותיו אבריה פרוש לעשוק מחרוזת תחת השיניים הקדמיות כדי להוציא את הראש שלו חזרה, כך קנה הנשימה ממוקם ישר ורמת שלה.
3. להרטיב את הגרון של העכבר, החזה, הבטן עם 70% אתנול כדי לחטא ולמנוע את הפרווה נדבקת על הכלים.
4. בעזרת מלקחיים רגיל, תמשוך בעור האמצע של הגוף, לגזור עם מספריים כירורגיים עד האמצע לחלק העליון של הגרון.
5. באמצעות הצד הקהה של מספריים כירורגיים סטנדרטי, בזהירות להזיז משם את השריר ורקמות על הגרון, להשתמש במספריים האביב (microscissors) כדי לחשוף את קנה הנשימה.
6. כשתפסת טבעת סחוס עם המלקחיים, עושים חתך קטן (~1.5 מ מ), באמצעות microscissors, על פני החדר של קנה הנשימה ובזהירות להוסיף של 18 גרם בצינורית לתוך קנה הנשימה.
7. בעדינות שטיפה 3 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), 1 מ"ל בכל פעם. בכל פעם למשוך בעדינות את הנוזל לתוך מזרק reinfuse אותו בחזרה לתוך הריאות, x 3 ברצף. לאחר איסוף של BALF, לבצע פריקה צוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד. להעביר את PBS שנאספו (~2.8 מ"ל), שהוא נוזל שטיפה bronchoalveolar (BALF), צינור, צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 10 דקות, ולאסוף את גלולה. להוסיף 1 מ"ל של PBS טריים שפופרת ואת צנטריפוגה ב x 1000 g 10 דקות לשטוף את ההריסות ולאסוף את המקרופאגים מכתשי pelleted.
8. Resuspend בגדר ב mL 2 בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM) עם 10% nonheat-לא פעיל העובר שור סרום (FBS) ו מקרופאגים מכתשי ראשי תרבות בתקשורת אותו במשך יומיים על צלחת זכוכית-התחתון על 37 ° C באווירה humidified.
9. וארוקן את המדיה הישנה, לשטוף אותו עם 1 מ"ל ל- PBS, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה חדשה. להוסיף חרוזים FITC (חרוזים לטקס carboxylated, 2 מיקרומטר בקוטר 50 חרוזים/תא), תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified.
10. לשטוף בהרחבה עם PBS (1 מ"ל בו-זמנית, עבור סכום כולל של חמישה שוטף) כדי להסיר את החרוזים חוץ-תאית. תמונה 100 תאים באופן אקראי ולספור את התאים עם חרוזים תאיים (488 ננומטר).
    הערה: אינדקסים Phagocytic הם מספר חרוזים בלע מחולק על ידי המספר הכולל של מקרופאגים; האחוז של תאים phagocytic הוא המספר של מקרופאגים זה להבלע חרוז אחד לפחות לחלק את המספר הכולל של מקרופאגים¹⁶.
    1. לחלופין, לאחר דגירה 1 h עם חרוזים, לשטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS, לעבד אותם עבור cytometry זרימה עבור כימות של phagocytosis. בדומה לכך, תהליך AMs בלי חרוזים כמו תאים וללא רבב או תאים שליטה. לחשב את הגישה החיובית אחוז ואני מתכוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית, באמצעות תוכנה cytometry זרימה, על-ידי בחירת אפשרויות אלה התוכנה.

2. FcγR ו- CR-בתיווך Phagocytosis

1. עבור opsonization, דגירה 2 x 10⁸ כבשים תאי דם אדומים (SRBCs) עם 50 µL של הארנב anti-SRBC-IgM או µL 50 של ארנב anti-SRBC-אג למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר¹¹.
2. דגירה IgM-opsonized SRBCs עם µL 50 של C5 לקויה (C5D) בנסיוב אדם למשך 30 דקות ב 37 ° C כדי לתקן את השברים המשלים C3b, C3bi על SRBCs מצופים IgM.
3. זרע תאי מקרופאג מאתר (MH-S תאים) (10,000 תאים טוב) לתוך צלחת 96-ובכן דגירה לילה כדי לקבל זרימה ~ 70%. להוסיף 100 µL של עונה 1 פרק 10⁷/mL opsonized SRBCs על כל טוב של תאים MH-S, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. שטיפה לא מאוגדים SRBCs מהר מאוד (~ 1 דקות) עם 100 µL אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק המאגר.
4. Lyse התאים עם 0.1% מרחביות ולהוסיף 50 µL של 2, 7-diaminofluorene (הדף היומי) המכילה מי חמצן 3%, אוריאה 6 מ'. למדוד את ספיגת של היווצרות מזורז-המוגלובין fluorene הכחול-620 ננומטר.
5. לקבוע את מספר SRBCs באמצעות עיקול רגיל ב- nm 620 ספיגת ערכים עם מספר ידוע של SRBCs. באופן דומה, תהליך MH-S תאי הדגירה עם SRBCs nonopsonized להשתמש כפקדים שלילי.

3. PRR בתיווך Phagocytosis

1. בצעו את צעדים 1.1-1.9 הבידוד, culturing של העכבר הראשי מכתשי מקרופאגים.
2. לאחר יומיים, מסיר את המדיה, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל ל- PBS, וכן להוסיף 500 µL של המדיה טריים המכילה bioparticles zymosan-A עבור חיל הים אלקסה-488-מצומדת (חלקיקים 100/תבשיל).
3. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. לעצור את phagocytosis על-ידי הוספת µL 500 ל- PBS קר כקרח.
4. לשטוף את התאים בהרחבה עם PBS (1 מ"ל בו-זמנית, עבור סכום כולל של חמישה שוטף). לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את התאים בהרחבה עם PBS (1 מ"ל בו-זמנית, עבור סכום כולל של חמישה שוטף) ולשמור את התאים ב- 500 µL ל- PBS.
6. תמונה התאים תחת התערבות דיפרנציאלית ניגודיות וכן ערוץ פלורסנט-488 ננומטר. לספור AMs המכיל bioparticles zymosan-A, לקבוע את אחוזי phagocytosis.

4. in Vivo Phagocytosis על ידי מקרופאגים מכתשי

הערה: לחסן aeruginosa פ GFP על צלחת אגר מזין, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום הבא, לחסן את המושבה יחיד 2 מ ל מרק מזין ולגדול החיידק ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

1. למחרת, עזים ומתנגד עכברים עם ממשל בקרום הבטן של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים. לאשר ההרדמה המתאים באמצעות חוסר התגובה ה"צביטה הבוהן.
2. להניח את העכבר על לוח שטוח עם גומייה מעבר החותכות העליונות ולמקם אותו בעמדה semirecumbent (45 מעלות) עם גחוני ואת פניו פונה כלפי מעלה. באופן חלקי באמצעות מלקחיים מעוקל, משכי הלשון. שימוש microsprayer, intratracheally לנהל 50 µL (5 x 10⁶ המושבה יוצרי יחידות [CFU])¹⁷ פ aeruginosa GFP לתוך הריאות של העכברים anesthetized.
3. לאחר h 1 לזיהום, בצע את שלבים 1.1-1.7.
4. Resuspend התאים PBS, cytocentrifuge אותם (1,000 x גרם, 1 דקות בטמפרטורת החדר) על זכוכית.
5. כתם באופן שונה את השקופיות cytospin מקרופאגים מכתשי, נויטרופילים של לימפוציטים, על פי הוראות היצרן.
6. באופן אקראי בחר 100 AMs, לספור את AMs המכיל חיידקים תאיים, לקבוע את אחוזי phagocytosis.

5. in Vivo חיידקים באמצעות סיווג aeruginosa פ

1. לחסן aeruginosa פ על צלחת אגר פ aeruginosa בידוד, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחסן את המושבה יחיד 2 מ ל מרק lysogeny (LB), לגדל את החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחשב את CFU, באמצעות הנוסחה הבאה.
   
   CFU/מ"ל = (מספר מושבות x פקטור דילול) / אמצעי האחסון של צלחת תרבות.
   
   לדלל את התרבות עם PBS להשיג את הרצוי CFU/mL.
2. 1 משפט, intratracheally מזריקים מנה לא קטלני של ~2.5 x 10⁵ CFU/mL aeruginosa פ לתוך ומורדמת פראי-סוג (WT) ו- TRIM72^קו עכברים, כאמור בשלב 4.2. מודדים את משקל הגוף מדי יום במשך 6 ימים.
3. 2 משפט, מזריקים מנה שנייה של פ aeruginosa (5 x 10⁵ CFU/mL) לתוך העכברים זה שרד ניסיון 1 ולמדוד את משקל הגוף במשך 4 ימים.
4. 3 משפט, באמצעות קבוצה שונה של עכברים, להזריק WT ו- TRIM72^קו עכברים עם מנה קטלנית (3 x 10⁷ CFU/mL) של aeruginosa פ ולהקליט את התמותה בתוך 2 ימי של הזרקת. חיות מראה סימנים של לחץ קשה כגון ירידה במשקל גוף משמעותי, הגב הכפוף, אנורקסיה או קוצר נשימה ייבחנו על ידי הוטרינרים המטפל. חיות חשוכת יוקרב מיד.
5. מוות או לאחר המתת חסד-יום 2 אחרי הזריקה, לאסוף את הרקמה כולה-לונג על כימות של הנטל ריאות חיידקית-שיא זיהום.
6. כדי לבדוק את הנטל ריאות חיידקית, להוסיף 200 µL של תמיסת לרקמות ריאות, homogenize אותם, שימוש בהגדרה נבדקו בעבר על מהמגן אלקטרונית זה משבש לחלוטין רקמת הריאה בלי לשבור את החיידקים. התאם את הנפח הכולל של homogenate הריאות כדי µL 100 מ ל 1 וצלחת של הריאות lysate על פלטות אגר בידוד Pseudomonas -דילולים טורי 10-fold.
7. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה, לספור מושבות חיידקים כדי לקבוע את CFU לכל כל הריאה.

6. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש הסטודנט t-test כדי לקבוע את משמעות ההבדל בין שתי הקבוצות הסטטיסטיות. שקול הבדל משמעותי סטטיסטית כאשר p < 0.05. כל הנתונים מוצגים כפי שאומר ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM).

תוצאות

אנחנו בוצע לראשונה את הניסוי כדי לנתח phagocytosis על ידי העכבר הראשי AMs. לאורך כל הבדיקות, השווינו AMs מבודד מן^KO עכברים WT ו- TRIM72. כפי שמוצג באיור 1א, פלורסצנטיות מיקרוסקופ חשף את phagocytosis מחרוזי זכוכית FITC על ידי העכבר AMs העיקרית מתרחשת אחרי h 1 של דגירה. ...

Discussion

תוך כדי ביצוע פונקציה חילופי גז, הריאה בהתמדה מתעמת עם חלקיקים זרים, פתוגנים, אלרגנים. AMs לספק את השורה הראשונה של הגנה מכוח תפקידם העיקרי, כלומר phagocytosis. AMs גם לתאם עם תאים חיסוניים אחרים להרוס פתוגנים, הרזולוציה של דלקת. כאן, אנחנו תיאר שיטות להערכת במיוחד phagocytosis מאת AMs מבודד מן הריאות העכבר. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade