Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Özet

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer alveoler alan koru. Fagositoz AMs tarafından istila karşı patojenler, ölü hücreleri veya yabancı parçacıklar kaldırılmasını savunmak için kritik bir rol oynamaktadır ve inflamatuar yanıt ve doku remodeling çözünürlüğünde, işler bu tarafından çeşitli yüzey reseptörlerinin aracılı AMs. Burada, desen tanıma reseptör-, Kompleman reseptör- ve Fc gama reseptör aracılı arasında ayırt etmek için tüp bebek ve içinde vivo deneyleri ve deneysel stratejiler kullanarak AMs fagositik fonksiyonu analizi için yöntemler raporu fagositoz. Son olarak, biz bir yöntem oluşturmak ve P. aeruginosa pnömoni manken bakteriyel yetkisi içinde vivo değerlendirmek farelerde karakterize tartışıyorlar. Bu deneyleri AM işlevleri değerlendirmek için en yaygın yöntemleri temsil ve makrofaj işlevi ve diğer organlarda bakteriyel Temizleme çalışması için de kullanılabilir.

Giriş

AMs büyük ikamet fagositler alveoller içinde dinlenme sahne ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanıma yoluyla büyük oyuncular ve inhale patojenler ve yabancı parçacıklar^1,2içselleştirilmesi vardır. Bu yüzden AM fagositoz bir eksikliği genellikle solunum içinde sonuçları AMs P. aeruginosa ve Klebsiella zatürre^3,4gibi birçok akciğer patojenlerin hızlı geçiş izni için gerekli olan bildirilmiştir yüksek mortalite ve morbidite oranları neden enfeksiyonlar, akut pnömoni gibi.

AMs Ayrıca akciğer doğuştan gelen inflamatuar yanıt sitokinler ve TNF-α ve IL-1β, hangi crosstalk kemokinler üretmek ve inflamatuar nötrofil, monosit, askere alveoler çevrenin diğer hücrelerle gibi kemokinler üreterek başlatmak ve edinilmiş bağışıklık hücreleri akciğer⁵. Örneğin, IL-1β AMs tarafından üretilen nötrofil Kemokin CXCL8 yayın epitel hücreleri⁶hazırlamak için yardımcı olur. Ayrıca, hücre içi enzimler sürekli kaçağı neden PMNs gelen başarısızlık çevreleyen doku, doku hasarı sonucu ve uzun süreli iltihap fagositoz apoptotik polimorfonükleer lökositlerin (PMNs), AMs katkıda ^{7 , 8 , 9}.

AMs tarafından fagositoz yanında kalıplarının patojen ilişkili moleküler patojen yüzeyi AMs desen tanıma reseptörleri (PRRs) veya opsonized patojenler bağlama AMs bağışıklık efektör reseptörleri ile doğrudan bir Tanıma aracılık ettiği ¹⁰. için ikinci, AMs immünglobulin (IgG) ile opsonized hedefleri onların Fcγ reseptörleri (FcγR) algılayabilir veya patojenler (CR)¹¹tamamlayıcı parçaları, C3b ve C3bi, onların tamamlayıcı reseptörleri ile kaplanmış. Kompleman reseptörü arasında immünglobulin süper (CRIg) CR doku makrofajlar¹²' seçmeli olarak ifade edilir ve son bulma AM fagositoz bağlamında P. aeruginosa pnömoni, CRIg rolü vurgulanacak ¹³.

Birçok özgün çalışma yöntemleri makrofaj işlevi^14,15moleküler mekanizmaları açıklamak için makrofaj fagositoz değerlendirmek için kullanın. Ancak, içinde vivo fagositoz gibi yöntemler fagositoz kesin bir miktar gerektirir. Burada, tüp bebek ve içinde vivo fagositoz floresein isothiocyanate (FITC) kullanarak için detaylı bir metodoloji özetlemek-cam boncuk ve P. aeruginosa yeşil flüoresan protein (GFP), anılan sıraya göre. Ayrıca, biz PRR, CR ve FcγR-aracılı fagositoz arasında differentiating yöntemi açıklar. Son olarak, bakteriyel temizleme Mouse P. aeruginosa pnömoni ile ilgili olarak niteleyen bir yöntemi bildirin.

Protokol

Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Doğu Virginia Tıp Fakültesi kuralları izler.

1. floresan boncuk fagositoz

1. Fare ötenazi (C57BL/6J, 6 hafta yaşlı, kadın) hayvanların IACUC iletişim kuralları etik ötenazi için göre CO₂ boğulma tarafından.
2. Kağıt havlu ile kaplı bir diseksiyon tahta üzerinde fareyi atmasından yatıyordu. Onun pençeleri ile onun bacaklarda spread-eagle pin ve böylece geri nefes borusunu düz konumlandırılmış başını çekmeye ön dişler ve düzeyi altında bir dize kanca.
3. Fare boğaz, göğüs ve karın dezenfekte ve kürk araçlar yapışmasını önlemek için % 70 etanol ile ıslak.
4. Düzenli forseps kullanarak, Cilt, vücut merkez yukarı çekin ve Merkez Cerrahi makas ile boğaz üstüne kesmek.
5. Standart Cerrahi makas künt sonuna kullanarak, dikkatle kas ve bağ dokusu üzerinde boğaz uzaklaşmaya ve trakea ortaya çıkarmak için Bahar makas (microscissors) kullanabilirsiniz.
6. Kıkırdak halka Forseps ile sürükleyici, dikkatle microscissors, nefes borusu ventrikül yüzünde kullanarak küçük bir insizyon attım (~1.5 mm), yapmak ve bir 18 G kanül nefes borusu yerleştirin.
7. Yavaşça lavaj fosfat tamponlu tuz (PBS), bir seferde 1 mL 3 mL. Her zaman hafifçe şırınga ve akciğer geri reinfuse içine sıvı geri art arda 3 x. BALF topladıktan sonra ötenazi sağlamak için servikal çıkığı gerçekleştirin. Pelet toplamak ve toplanan PBS bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) olan (~2.8 mL), bir tüp, 10 dk 1000 x g, santrifüj transfer. Taze PBS 1 mL tüp ve santrifüj 1000 x g enkaz yıkama ve pelleted alveoler makrofajlar toplamak için 10 dakika için de ekleyin.
8. Pelet 2 ml % 10 nonheat inaktive fetal sığır serum (FBS) ve kültür birincil alveoler makrofajlar aynı medya ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 2 gündür oksijen bir atmosferde 37 ° C'de bir cam alt çanak üzerinde resuspend.
9. Eski medya Aspire edin, PBS 1 mL ile yıkayın ve 2 mL taze medya ekleyin. FITC boncuk (Karboksile lateks boncuk, çapı 2 µm, 50 boncuk/hücre) ekleyin ve oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
10. Kapsamlı ekstraselüler boncuk kaldırmak için PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) ile yıkayın. 100 hücreleri Rastgele Resim ve hücre içi boncuk ile hücreleri saymak (488 nm).
    Not: Phagocytic dizinler hafızanın boncuk makrofajlar toplam numarasına göre bölünmüş vardır; Fagositik hücreleri makrofajlar¹⁶toplam numarasına göre bölünmüş en az bir boncuk yemek makrofajlar sayısı yüzdesidir.
    1. Alternatif olarak, 1 h kuluçka boncuk ile sonra PBS 3 mL hücrelerle yıkama ve onları fagositoz miktar için Akış Sitometresi için süreç. Benzer şekilde, AMs günahı hücreleri veya kontrol hücreleri olarak boncuk olmadan işlem. Yüzde pozitifliği hesaplamak ve floresan yoğunluğu, Akış Sitometresi yazılım, yazılımın bu seçenekleri seçerek kullanarak demek.

2. FcγR ve CR aracılı fagositoz

1. Opsonizasyonla için 2 x 10⁸ koyun kırmızı kan hücreleri (SRBCs) ile 50 µL tavşan anti-Hazırlanan-IgM ya da tavşan anti-Hazırlanan-IgG için oda sıcaklığında¹¹30 dk 50 µL kuluçkaya.
2. SRBCs ile 50 µL 37 ° C'de 30 dk için C5-eksik (C5D) insan serum IgM opsonized tamamlayıcı parçaları C3b ve C3bi IgM kaplı SRBCs düzeltmek için kuluçkaya.
3. Tohum fare makrofaj hücreleri (MH-S hücreleri) (10.000 hücre/de) bir 96-şey plaka ve ~ %70 izdiham almak için bir gecede kuluçkaya. 1 x 10⁷/mL 100 µL SRBCs MH-S hücreleri her şey için opsonized ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Yıkama bağlı olmayan SRBCs çok hızlı (~ 1 dk) amonyum klorür-potasyum (ACK) lizis arabelleği 100 µL ile.
4. % 0.1 SDS içeren hücreleri parçalayıcı ve 2,7-diaminofluorene (DAF) %3 hidrojen peroksit ve 6 M üre içeren 50 µL ekleyin. 620, fluorene mavi hemoglobin katalize oluşumu Absorbans ölçmek nm.
5. Standart bir eğri 620 nm Absorbans değerleriyle SRBCs bilinen bir dizi kullanarak SRBCs sayısını belirleyin. Benzer şekilde, işlem MH-S hücreleri negatif denetimlerini kullanmak için nonopsonized SRBCs ile inkübe.

3. PRR aracılı fagositoz

1. 1.1-1.9 yalıtım ve fare birincil alveoler makrofajlar kültür için adımları izleyin.
2. 2 gün sonra medyayı çıkarın, PBS 1 mL hücrelerle yıkayın ve taze medya Alexa Fluor 488 Birleşik zymosan-A bioparticles (100 parçacıklar/çanak) içeren 500 µL ekleyin.
3. 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Fagositoz buz gibi PBS 500 µL ekleyerek durdurmak.
4. PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) yoğun hücrelerle yıkayın. %4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 10 dakika ile hücreleri tamir.
5. PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) yoğun hücrelerle yıkama ve hücreleri PBS 500 µL içinde tutmak.
6. Hücreleri farklı girişim kontrast ve 488 floresan bir kanalda altında görüntü nm. Zymosan-A bioparticles içeren AMs saymak ve fagositoz yüzdesini belirlemek.

4. içinde Vivo fagositoz alveoler makrofajlar tarafından

Not: P. aeruginosa GFP besin agar tabağa aşılamak ve 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya. Ertesi gün, koloni besin suyu 2 ml aşılamak ve 37 ° C'de bakteri gecede büyümek.

1. Ertesi gün, 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine mayi bir yönetim ile fareler anestezi. Uygun anesthetization yanıt-e doğru ayak parmağı çimdik eksikliği ile onaylayın.
2. Fareyi düz bir tahta üzerinde bir lastik bant ile üst kesici dişler arasında yatıyordu ve menfez yüzey ve yukarı bakacak şekilde Kürsüsü ile semirecumbent (45 °) pozisyonda yerleştirin. Eğri forseps kullanarak, kısmen dil geri çek. Bir microsprayer kullanarak, intratracheally 50 µL (5 x 10⁶ koloni oluşturan birimler [CFU])¹⁷ / P. aeruginosa GFP imzalat farelerin ciğerlerine yönetmek.
3. Enfeksiyon 1 saat sonra adımları 1.1-1.7.
4. PBS ve cytocentrifuge hücrelerde resuspend bir cam slayt üzerine onları (1000 x g, oda sıcaklığında 1 dk).
5. Differentially alveoler makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler, cytospin slaytlarını üreticinin yönergelerine göre leke.
6. Rastgele 100 AMs seçin, hücre içi bakteri içeren AMs saymak ve fagositoz yüzdesini belirlemek.

5. Vivo içinde bakteri izni kullanarak P. aeruginosa

1. P. aeruginosa P. aeruginosa yalıtım agar tabağa aşılamak ve 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya. Koloni lysogeny suyu (LB) 2 ml aşılamak ve 37 ° C'de bakteri gecede büyümek. CFU, aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar.
   
   CFU/mL = (kolonileri seyreltme faktörü x sayısı) / kültür plaka hacmi.
   
   İstenen CFU/mL almak için PBS ile Kültür sulandırmak.
2. Deneme 1'de, intratracheally enjekte ~2.5 x 10⁵ CFU/mL P. aeruginosa sublethal bir doz imzalat vahşi-türü (WT) ve TRIM72^KO fareler, adım 4.2 belirtildiği gibi. Vücut ağırlığı her gün 6 gündür ölçmek.
3. Deneme 2'de, P. aeruginosa (5 x 10⁵ CFU/mL) ikinci bir doz deneme 1'hayatta ve vücut ağırlığı 4 gündür ölçmek fareler içine enjekte.
4. Deneme 3, fareler, farklı bir dizi kullanarak WT ve TRIM72^KO fareler bir öldürücü doz P. aeruginosa ile (3 x 10⁷ CFU/mL) enjekte ve mortalite enjeksiyon 2 gün içinde kaydedin. Önemli vücut kilo kaybı gibi ciddi stres belirtileri gösteren hayvanlar, kambur sırt, anoreksiya veya Dispne uzman veterinerler tarafından değerlendirilecektir. Tedavi edilemez hayvanlar hemen kaldırılır.
5. Ya ölüm ya da ötenazi, enjeksiyon sonra 2 gün sonra bütün akciğer dokusu miktar itibariyle en yüksek enfeksiyon akciğer bakteriyel yükünün için toplamak.
6. Akciğer bakteriyel yük sınamak için akciğer dokusu normal salin 200 µL eklemek ve onları, bakteri bozmadan akciğer dokusu tamamen bozan bir elektronik homogenizer üzerinde daha önce test ayarı kullanarak homojenize. Akciğer homogenate 1 mL ve plaka 100 µL akciğer Pseudomonas yalıtım agar plakaları 10 kat seri dilutions adlı lysate için toplam ses düzeyini ayarlayın.
7. Plakayı 24 h 37 ° C'de kuluçkaya ve bütün akciğer başına CFU belirlemek için bakteri kolonileri say.

6. istatistiksel analiz

1. Kullanın bir öğrenci t-testi iki grup arasındaki fark istatistiksel anlamlılık belirlemek için. İstatistiksel olarak anlamlı bir fark ne zaman düşünün p < 0,05. Tüm verileri (SEM) ortalama ± standart hatasını aracı olarak sunulmaktadır.

Sonuçlar

Fagositoz fare tarafından analiz için deney yapılan ilk birincil AMs. Tüm analizleri AMs WT ve TRIM72^KO fareler izole karşılaştırıldığında. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi Floresans mikroskobu o fagositoz FITC-cam boncuk birincil AMs oluşur kuluçka 1 h sonra fare tarafından saptandı. Resim 1 B Akış Sitometresi tarafından fagositoz analizini gösterir. Mikroskopi ...

Tartışmalar

Gaz değişimi işlevi yerine getirirken, akciğer ısrarla yabancı parçacıklar, patojenler ve alerjenleri yüzleşir. AMs onların ana işlevi, yani fagositoz gereğince savunma ilk satırı sağlar. AMs da diğer bağışıklık hücreleri patojenleri yok ve inflamasyon çözünürlük ile koordine. Burada, biz yöntemleri özellikle fare akciğer izole AMs tarafından fagositoz değerlendirmek için nitelendirdi. Bu el yazması sunulan Protokolü makrofaj işlevi ve diğer organlarında bakteri izni çalışmaya da...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade