Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Resumen

Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.

Resumen

Los macrófagos alveolares (AMs) guardan el espacio alveolar del pulmón. Fagocitosis por AMs juega un papel fundamental en la defensa contra los invasores patógenos, la eliminación de células muertas o partículas extrañas y en la resolución de las respuestas inflamatorias y la remodelación tisular, procesos que son mediados por receptores distintos de la superficie de las AMs. Aquí, Divulgamos los métodos para el análisis de la función fagocítica de AMs usando estrategias experimentales y ensayos in vitro e in vivo para diferenciar entre el receptor de reconocimiento patrón-, receptor de complemento- y Fc gamma mediada por receptor fagocitosis. Finalmente, se discute un método para establecer y caracterizar un modelo de neumonía de p. aeruginosa en ratones para evaluar in vivo la eliminación bacteriana. Estos ensayos representan los métodos más comunes para evaluar las funciones de AM y también pueden utilizarse para estudiar la función de macrófagos y de remoción bacteriana en otros órganos.

Introducción

AMs son los principales fagocitos residente en los alvéolos en la etapa de descansa y uno de los principales actores de la respuesta inmune innata a través del reconocimiento y la internalización de patógenos inhalados y partículas^1,2. Se ha reportado que AMs son esencial para la separación rápida de muchos patógenos pulmonares, como p. aeruginosa y Klebsiella pneumoniae^3,4, por lo que una deficiencia en la fagocitosis de AM con frecuencia resulta en respiratorias infecciones, como neumonía aguda, que causan mayores tasas de mortalidad y morbilidad.

AMs también iniciar innatas respuestas inflamatorias en el pulmón mediante la producción de citoquinas y quimioquinas como TNF-α y IL-1β, que interferencia con otras células del ambiente alveolar para producir quimiocinas y reclutar inflamatorias neutrófilos, monocitos, y células inmunes adaptantes en el pulmón⁵. Por ejemplo, IL-1β producido por AMs ayuda a la liberación de lo neutrófilo chemokine CXCL8 de células epiteliales⁶. Por otra parte, el AMs contribuyen a la fagocitosis de la apoptosis de leucocitos polimorfonucleares (PMNs), fracaso del que conduce a la pérdida sostenida de enzimas intracelulares de PMNs al tejido circundante, resultando en daño tisular y la inflamación prolongada ^{7 , 8 , 9}.

Fagocitosis por las AMs está mediada por un reconocimiento directo de patrones moleculares asociados a patógenos en la superficie de patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) de las AMs o por la Unión de patógenos opsonizadas con receptores inmunes efectoras de las AMs ¹⁰. para este último, AMs puede reconocer los objetivos opsonizadora con inmunoglobulina (IgG) a través de sus receptores de Fcγ (FcγR) o los patógenos recubiertos de fragmentos del complemento, C3b y C3bi, a través de sus receptores de complemento (CR)¹¹. Entre los receptores del complemento, el CR de la superfamilia de las inmunoglobulinas (CRIg) se expresa selectivamente en los macrófagos de tejido¹², y un reciente hallazgo destacó el papel del CRIg en fagocitosis de AM en el contexto de la pulmonía de p. aeruginosa ¹³.

Muchos estudios originales utilizan métodos para evaluar la fagocitosis de macrófagos para describir los mecanismos moleculares de la función de macrófagos^14,15. Sin embargo, métodos como la fagocitosis in vivo requieren una cuantificación precisa de la fagocitosis. Aquí, se resume una metodología detallada para la fagocitosis in vitro e in vivo con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-cristal granos y proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Además, se explica el método de diferenciar entre PRR, CR y fagocitosis mediada por FcγR. Por último, se presenta un método para caracterizar la remoción bacteriana en ratón con respecto a p. aeruginosa neumonía.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas de la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Eastern Virginia Medical School.

1. fluorescente granos fagocitosis

1. Eutanasia el ratón (C57BL/6J, 6 semanas de edad, mujer) por CO₂ asfixia según protocolos IACUC para la eutanasia ética de los animales.
2. Coloque el ratón pique en una tabla de disección cubierta con toallas de papel. Precisar sus patas con sus extremidades spread-eagle y enganchar una cadena bajo sus dientes delanteros tirando su cabeza hacia atrás para que la tráquea quede recto y nivel.
3. Mojar la garganta, pecho y vientre con etanol al 70% para desinfectar y evitar que la piel se pegue a las herramientas del ratón.
4. Con fórceps regular, tire de la piel en la línea central del cuerpo y cortar con tijeras quirúrgicas para arriba de la línea central a la parte superior de la garganta.
5. Cuidadosamente con el extremo despuntado de tijeras quirúrgicas estándar, alejar el músculo y los tejidos conectivos en la garganta y utilizar tijeras de primavera (microscissors) para exponer la tráquea.
6. Agarrar un anillo de cartílago con las pinzas, con cuidado haga una pequeña incisión (~1.5 mm), con microscissors, en la cara del ventrículo de la tráquea e Inserte una cánula 18 G en la tráquea.
7. Lavado cuidadosamente 3 mL de tampón fosfato salino (PBS), 1 mL a la vez. Cada vez que retire suavemente el líquido en la jeringa y el infundir de nuevo en el pulmón, 3 x en la sucesión. Después de recoger el BALF, realizar la dislocación cervical para asegurar la eutanasia. El PBS recogido (~2.8 mL), que es el lavado broncoalveolar (BALF), la transferencia a un tubo, centrifugar a 1.000 x g durante 10 min y recoger el diábolo. Añadir 1 mL de PBS fresco al tubo y centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos lavar los residuos y recoger los alimentos peletizados macrófagos alveolares.
8. Resuspender el precipitado en 2 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% inactivado le suero bovino fetal (FBS) y macrófagos alveolares primarios de la cultura en los mismos medios por 2 días en un plato de fondo de cristal a 37 ° C en un ambiente humidificado.
9. Aspirar viejos media, lave con 1 mL de PBS y añadir 2 mL de medio fresco. Añadir granos FITC (cuentas de látex carboxilado, 2 μm de diámetro, 50 perlas/célula) e Incube por 1 h a 37 ° C en un ambiente humidificado.
10. Lavar exhaustivamente con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados) para quitar granos extracelulares. Imagen 100 células al azar y contar las células con los granos intracelulares (488 nm).
    Nota: fagocítico índices son el número de granos ingeridos dividido por el número de macrófagos; el porcentaje de células fagocíticas es el número de macrófagos que ingieren al menos una bola dividida por el número total de macrófagos¹⁶.
    1. Alternativamente, después de una incubación de 1 h con los granos, lavar las células con 3 mL de PBS y procesarlas para citometría de flujo para la cuantificación de la fagocitosis. Del mismo modo, proceso, AMs sin granos sin manchas de células como las células del control. Calcular el porcentaje de positividad y media intensidad de fluorescencia, utilizando software de citometría de flujo, seleccionando las opciones en el software.

2. fagocitosis mediada por FcγR y CR

1. Para la opsonización, incubar 2 x 10⁸ ovejas células de sangre rojas (SRBCs) con 50 μl de conejo anti-anuarios-IgM o 50 μl de conejo anti-anuarios-IgG durante 30 min a temperatura ambiente¹¹.
2. Incubar SRBCs IgM opsonizadora con 50 μl de suero humano C5-deficientes (C5D) durante 30 min a 37 ° C para fijar los fragmentos del complemento C3b y C3bi en SRBCs cubierto de IgM.
3. Macrófagos murinos (células MH-S) de la semilla (10.000 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos y se incuba durante la noche para conseguir una confluencia de ~ 70%. Añadir 100 μl de 1 x 107/ml opsonizadora SRBCs en cada pocillo de las células de MH-S e incubar 1 h a 37 ° C. Lavado sin consolidar SRBCs muy rápidamente (~ 1 min) con 100 μl de tampón de lisis (ACK) de cloruro de amonio y potasio.
4. Lyse las células con el 0,1% de SDS y añadir 50 μl de 2, 7-diaminofluorene (DAF) que contiene 6 M urea y peróxido de hidrógeno 3%. Medir la absorbancia de la formación de la hemoglobina-catalizada fluoreno azul a 620 nm.
5. Determinar el número de SRBCs utilizando una curva estándar en los valores de absorbancia de 620 nm con un número conocido de SRBCs. Del mismo modo, proceso MH-S células incuban con nonopsonized SRBCs para usar como controles negativos.

3. PRR-mediada por la fagocitosis

1. Siga los pasos 1.1-1.9 para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares primarios de ratón.
2. Después de 2 días, eliminar los medios de comunicación lavan las células con 1 mL de PBS y agregar 500 μl de medios frescos que contienen biopartículas zymosan-A Alexa Fluor 488 conjugado (100 partículas/plato).
3. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Añadir 500 μl de PBS helada para detener la fagocitosis.
4. Lavar las células con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados). Fijar las células con paraformaldehído al 4% por 10 min a temperatura ambiente.
5. Lavar las células con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados) y mantener las células en 500 μl de PBS.
6. Imagen de las células en contraste de interferencia diferencial y un canal fluorescente en 488 nm. AMs con zymosan-A biopartículas y determinar el porcentaje de fagocitosis.

4. en Vivo la fagocitosis por los macrófagos alveolares

Nota: p. aeruginosa GFP de inocular en una placa de agar nutritivo e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Al día siguiente, inocular la Colonia solo a 2 mL de caldo nutritivo y crecen las bacterias a 37° C durante la noche.

1. Al día siguiente, anestesiar ratones con administración intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Confirmar la anestesia adecuada a través de una falta de respuesta a la presión del dedo del pie.
2. Coloque el ratón sobre un tablero plano con una banda elástica sobre los incisivos superiores y coloque en una posición semisentada (45°) con la superficie ventral y hacia arriba de la tribuna. Con unas pinzas curvas, parcialmente retrae la lengua. Usando un microsprayer, PCSC administrar 50 μl (5 x 10⁶ unidades formadoras de colonias [CFU])¹⁷ de p. aeruginosa GFP en los pulmones de los ratones anestesiados.
3. Después de 1 h de la infección, siga los pasos 1.1-1.7.
4. Resuspender las células en PBS y Citocentrifuga ellos (1.000 x g, 1 min a temperatura ambiente) en un portaobjetos de vidrio.
5. Diferencialmente la mancha cytospin algunas diapositivas de los macrófagos alveolares, neutrófilos y linfocitos, según las instrucciones del fabricante.
6. Al azar seleccione 100 AMs cuenta AMs que contienen bacterias intracelulares y determinar el porcentaje de fagocitosis.

5. en Vivo bacterias separación usando el p. aeruginosa

1. P. aeruginosa de inocular en una placa de agar de aislamiento de p. aeruginosa e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Inocular la Colonia solo 2 ml de caldo de lisogenia (LB) y crecen las bacterias a 37° C durante la noche. Calcular la UFC, utilizando la siguiente fórmula.
   
   UFC/mL = (número de colonias x factor de dilución) / volumen de la placa de cultivo.
   
   Diluir la cultura con PBS para obtener las UFC/mL deseada.
2. En el ensayo 1, PCSC inyectar una dosis subletal de ~2.5 x 10⁵ UFC/mL de p. aeruginosa anestesiado wild-type (WT) y TRIM72 ratones^KO , como se indica en el paso 4.2. Medir el peso corporal diariamente durante 6 días.
3. En el ensayo 2, inyectar una segunda dosis de p. aeruginosa (5 x 10⁵ UFC/mL) en los ratones que sobrevivieron en 1 prueba y medir el peso corporal durante 4 días.
4. En el ensayo 3, utilizando un conjunto diferente de ratones, ratones^KO de WT y TRIM72 se inyectan con una dosis letal (3 x 10⁷ UFC/mL) de p. aeruginosa y registrar la mortalidad dentro de 2 días de la inyección. Animales que muestren signos de estrés severo como pérdida de peso significativa, espalda jorobada, anorexia y disnea será evaluada por los veterinarios asistentes. Animales serán sacrificados inmediatamente.
5. En la muerte o después de la eutanasia en el día 2 después de la inyección, recoger el tejido pulmonar total para la cuantificación de la carga bacteriana del pulmón en infección de pico.
6. Para probar la carga bacteriana del pulmón, añadir 200 μL de solución salina normal a los tejidos pulmonares y homogeneizarlas, utilizando un ajuste previamente probado en un homogeneizador electrónico que interrumpe totalmente el tejido pulmonar sin romper las bacterias. Ajustar el volumen total del homogeneizado de pulmón a 1 mL y la placa de 100 μl de pulmón lisado en placas de agar de aislamiento de Pseudomonas en diluciones en serie 10 veces.
7. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 horas y contar las colonias bacterianas para determinar la UFC por pulmón entero.

6. estadístico análisis

1. Uso del estudiante t-pruebas para determinar la significación estadística de la diferencia entre los dos grupos. Considerar una diferencia estadísticamente significativa cuando p < 0.05. Todos los datos se presentan como medios ± error estándar de la media (SEM).

Resultados

Primero realizamos el experimento para analizar fagocitosis por ratón AMs primarias. A lo largo de todos los análisis, se compararon las AMs aislados de ratones^KO de WT y TRIM72. Como se muestra en la figura 1A, microscopía de fluorescencia reveló la fagocitosis de FITC-abalorios por ratón AMs primarias ocurre después de 1 h de incubación. Figura 1 B muestra el análisis de la f...

Discusión

Al realizar una función de intercambio de gas, el pulmón persistente se enfrenta a alérgenos, agentes patógenos y partículas extrañas. AMs proporcionan la primera línea de defensa en virtud de su función principal, es decir, fagocitosis. AMs también coordinar con otras células a destruir los patógenos y en la resolución de la inflamación. Aquí, hemos descrito los métodos para evaluar específicamente la fagocitosis por AMs aislada del pulmón del ratón. El protocolo presentado en este manuscrito, explica ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade