Альвеолярных макрофагов фагоцитоза и распродажа бактерий в мышей

Резюме

Здесь мы приводим общие методы для анализа фагоцитарную функцию мышиных альвеолярных макрофагов и бактериальных Распродажа из легких. Эти методы исследования в пробирке фагоцитоз флуоресцеин Изотиоцианаты бусы и в естественных условиях фагоцитоз Pseudomonas aeruginosa зеленого флуоресцентного белка. Мы также описывают метод для очистки P. aeruginosa мышей.

Аннотация

Альвеолярных макрофагов (AMs) гвардии пространство альвеолярных легких. Фагоцитоз, AMs играет решающую роль в обороне против вторгаясь патогенов, удаление омертвевших клеток или посторонних частиц и в резолюции воспалительных реакций и тканей ремоделирования, процессов, посредничестве различные поверхности рецепторы AMs. Здесь мы приводим методы для анализа фагоцитарной функции с помощью экспериментальных стратегий и в vitro и in vivo анализов различать шаблон признание рецептор-, рецептор комплемента- и гамма Fc рецептор опосредованный AMs фагоцитоз. Наконец мы рассмотрим метод, чтобы установить и характеризуют P. aeruginosa пневмонии модели мышей для оценки бактериальных Распродажа в естественных условиях. Эти анализы являются наиболее распространенными методами для оценки функции AM и может также использоваться для изучения функции макрофагов и бактериальных Распродажа в других органах.

Введение

АПП являются крупные резидентов фагоцитов в альвеолах в стадии покоя и один из основных игроков врожденные иммунные реакции через признание и интернализации ингаляционных патогенов и инородных частиц^1,2. Сообщалось, что AMs имеют важное значение для быстрого разминирования многих легочных патогены, например P. aeruginosa и клебсиеллы пневмонии^3,4, так что дефицит в AM фагоцитоза часто приводит к респираторных инфекции, такие как острая пневмония, которые вызывают более высокие показатели смертности и заболеваемости.

АПП также инициировать врожденной воспалительные реакции в легких, производство цитокинов и chemokines например ФНО α, ИЛ 1β, какой уровень помех с другими клетками альвеолярного среды для производства chemokines и набирать воспалительных нейтрофилов, моноцитов, и Адаптивная иммунные клетки в легких⁵. Например ИЛ 1β, производимые AMs помогает премьер высвобождение нейтрофилов хемокиновых CXCL8 из эпителиальных клеток⁶. Кроме того АПП способствовать фагоцитоз apoptotic полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ), отказ которых приводит к постоянной утечки внутриклеточных ферментов из ПНЛ окружающие ткани, что приводит к повреждению тканей и длительное воспаление ^{7 , 8 , 9}.

Фагоцитоз, AMs опосредуется прямого признания патоген связанные молекулярные узоры на поверхности патогена шаблон признание рецепторов (ПРРС) АПП или привязки опсонизированными патогенов с рецепторами иммунной эффекторных АПП ¹⁰. для последнего, AMs может признать целей опсонизированными с иммуноглобулина (IgG) через их Fcγ рецепторы (FcγR) или патогенов с фрагментов комплемента, C3b и C3bi, через их дополнения рецепторов покрытием (CR)¹¹. Среди дополнения рецепторов выборочно CR суперсемейства иммуноглобулинов (CRIg) выражается в ткани макрофагами¹², и недавнее заключение подчеркнул роль CRIg в AM фагоцитоза в контексте P. aeruginosa пневмонии ¹³.

Многие оригинальные исследования использовать методы для оценки фагоцитоз макрофага описать молекулярных механизмов макрофагов функция^14,15. Однако методы как в естественных условиях фагоцитоза требуют точную количественную оценку фагоцитоза. Здесь, мы суммируем подробная методология для фагоцитоза в vitro и in vivo, используя флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-стеклянные бусы и P. aeruginosa Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), соответственно. Кроме того мы объяснить метод дифференциации среди PRR-, CR- и FcγR опосредованной фагоцитоза. Наконец мы сообщаем метод характеризовать бактериальных Распродажа в мыши отношении P. aeruginosa пневмонии.

протокол

Этот протокол следует принципам институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Восточной Вирджинии медицинской школы.

1. флуоресцентные бусинки фагоцитоз

1. Усыпить мыши (C57BL/6J, 6 недель, женщины) CO₂ удушение согласно IACUC протоколы для этического эвтаназии животных.
2. Положите мыши животе на доске рассечение, покрытые бумажные полотенца. Придавить его лапы с spread-eagle конечностей и подключить строку под его передних зубов тянуть его голову назад, так что трахеи располагается прямо и уровня.
3. Влажные мыши горло, грудь и живот с 70% этанол лечить и предотвращать мех от прилипания к инструментам.
4. С помощью регулярных щипцы, подтянуть кожу на осевой линии тела и сократить с Ножницы хирургические до осевой линии в верхней части горла.
5. Использование тупой конец стандартные хирургические ножницы, тщательно отойти на горло мышц и соединительной ткани и использовать весной ножницы (microscissors) для предоставления трахеи.
6. Сжимая кольцо хряща с щипцами, тщательно сделать небольшой надрез (~1.5 мм), используя microscissors, на лице желудочка трахеи и Вставьте канюлю 18 G в трахею.
7. Аккуратно промывание 3 мл фосфат амортизированное saline (PBS), 1 мл за один раз. Каждый раз мягко вывести жидкость в шприц и reinfuse его обратно в легких, 3 раза подряд. После сбора BALF, выполняют шейки матки дислокации для обеспечения эвтаназии. Передать трубку, центрифуги на 1000 x g за 10 мин, собранных PBS (~2.8 мл), которая является Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF), и собирать гранулы. Добавьте 1 mL свежих PBS в трубку и центрифуги на 1000 x g 10 мин мыть мусора и собирать гранулированных альвеолярные макрофаги.
8. Ресуспензируйте гранулы в 2 мл среды (DMEM) Дульбекко изменение орла с 10% nonheat инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и культуры первичной альвеолярных макрофагов в тех же СМИ за 2 дня на блюде стекло дно при 37 ° C в атмосфере увлажненной.
9. Аспирационная старых СМИ, промойте его с 1 мл раствора PBS и добавить 2 мл свежего средств массовой информации. Добавить FITC бусины (карбоксилатные латексные шарики, 2 мкм в диаметре, 50 бусы/клеток) и инкубировать 1 час при 37 ° C в атмосфере увлажненной.
10. Мыть широко с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять смывки) для удаления внеклеточного бусины. Случайно изображение 100 клеток и подсчитать количество ячеек с внутриклеточной бусины (488 нм).
    Примечание: фагоцитарный индексы являются количество попадает бусы, деленное на общее количество макрофагов; процент фагоцитирующих клеток — количество макрофаги, которые глотать по крайней мере один шарик, деленное на общее количество макрофаги¹⁶.
    1. Кроме того после 1 ч инкубации с бисером, вымыть клетки с 3 мл PBS и обрабатывать их для проточной цитометрии для количественной оценки фагоцитоза. Аналогичным образом процесс AMs без бисера как безупречный ячейки или элемент управления. Рассчитать процент позитивность и означают интенсивности флуоресценции, использованием потока цитометрии программное обеспечение, выбрав эти варианты в программном обеспечении.

2. FcγR - и CR-опосредованной фагоцитоз

1. Для опсонизацию проинкубируйте 2 x 10⁸ овец красные кровяные клетки (SRBCs) с 50 мкл кролик анти SRBC-IgM или 50 мкл кролика, анти SRBC-IgG за 30 мин при комнатной температуре¹¹.
2. Инкубируйте IgM опсонизированными SRBCs с 50 мкл человеческой сыворотки C5-недостаточным (C5D) на 30 минут при 37 ° C для фиксации фрагментов дополнения C3b и C3bi на IgM покрытием SRBCs.
3. Семя мышиных макрофагов (клетки MH-S) (10 000 клеток/а) в 96-луночных пластине и инкубировать на ночь, чтобы получить сочетанием ~ 70%. Добавить 100 мкл/мл 1 x 10-⁷опсонизированными SRBCs в каждой скважине MH-S клеток и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Мыть несвязанные SRBCs очень быстро (~ 1 мин) с 100 мкл буфера lysis аммония хлорид калия (ACK).
4. Лизировать клетки с 0.1% SDS и добавьте 50 мкл 2,7-diaminofluorene (DAF), содержащий 3% перекиси водорода и 6 М мочевины. Измерение оптической плотности формирования гемоглобина катализированное флуорена синий на 620 Нм.
5. Определите количество SRBCs с помощью стандартной кривой в 620 Нм значения поглощения с известным количеством SRBCs. Аналогичным образом процесс MH-S клетки инкубировали с nonopsonized SRBCs для использования в качестве негативных элементов.

3. PRR-опосредованной фагоцитоз

1. Выполните шаги 1,1-1,9 для изоляции и культивирования мышь первичной альвеолярных макрофагов.
2. После 2 дней удалите средства массовой информации, вымыть клетки с 1 мл раствора PBS и 500 мкл свежих сред, содержащих Alexa Fluor-488-конъюгированных zymosan-A bioparticles (100 частиц/блюдо).
3. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Остановите фагоцитоза, добавив 500 мкл ледяной PBS.
4. Вымойте клетки активно с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять автомойки). Исправьте клетки с параформальдегида 4% за 10 мин при комнатной температуре.
5. Вымыть клетки активно с PBS (1 мл в то время, в общей сложности пять смывки) и сохранить клетки в 500 мкл PBS.
6. Изображение клетки под дифференциальной помехи контраст и флуоресцентные канала в 488 нм. AMs, содержащие zymosan-A bioparticles и определить процент фагоцитоза.

4. в естественных условиях фагоцитоза, альвеолярные макрофаги

Примечание: Прививок P. aeruginosa GFP на тарелку питательный агар и инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. На следующий день прививок одной колонии по 2 мл бульона, питательных и расти бактерий при 37° C на ночь.

1. Следующий день, анестезировать мышей с внутрибрюшинного отправления Ксилазина кетамина и 10 мг/кг 100 мг/кг. Подтверждение правильного анестезии через отсутствие реакции на мыс пинча.
2. Положите мыши на плоской доски с резинкой через верхние резцы и поместите его в semirecumbent (45°) положении с вентральной поверхности и трибуны, вверх. С помощью Изогнутый пинцет, частично отозвать язык. Intratracheally управления microsprayer, 50 мкл (5 х 10⁶ образуя колонии единиц [CFU])¹⁷ P. aeruginosa GFP в легкие наркотизированных мышей.
3. После 1 h инфекции выполните шаги 1.1-1.7.
4. Ресуспензируйте клетки в PBS и cytocentrifuge их (1000 x g, 1 мин при комнатной температуре) на стеклянное скольжение.
5. Дифференциально пятно cytospin слайды для альвеолярные макрофаги и нейтрофилы, лимфоциты, согласно инструкциям производителя.
6. Случайным образом выбрать 100 AMs, подсчета АПП, содержащие внутриклеточных бактерий и определить процент фагоцитоза.

5. в естественных условиях бактерии разминирования с помощью P. aeruginosa

1. Прививок P. aeruginosa на тарелку агар P. aeruginosa изоляции и инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. Прививок одной колонии до 2 мл бульона lysogeny (LB) и расти бактерий при 37° C на ночь. Вычислите CFU, с помощью следующей формулы.
   
   КОЕ/мл = (количество колоний x коэффициент разрежения) / объем пластину культуры.
   
   Разбавьте культуры с PBS для получения желаемого кое/мл.
2. В пробной 1, intratracheally придать сублетальных доз ~2.5 x 10⁵ кое/мл P. aeruginosa наркотизированных одичал тип (WT) и TRIM72^KO мышей, как указано в шаге 4.2. Измерьте вес тела ежедневно в течение 6 дней.
3. В пробной 2 ввести вторую дозу P. aeruginosa (5 x 10⁵ кое/мл) в мышей, которые выжили в пробной 1 и измерения массы тела в течение 4 дней.
4. В пробной 3, используя другой набор мышей придать WT и TRIM72^KO мышей с смертельной дозы (3 x 10⁷ кое/мл) P. aeruginosa и запишите смертность в течение 2 дней после инъекции. Признаки тяжелой стресса, такие как потеря веса значительное тела животных, сгорбленная обратно, анорексия или одышка будут оцениваться путем посещения ветеринары. Неизлечимыми животных будет жертвовать немедленно.
5. В момент смерти или после эвтаназии на 2 день после инъекции Соберите целое легочной ткани для количественной оценки легких бактериальной нагрузки на пик инфекции.
6. Чтобы проверить легких бактериальной нагрузки, 200 мкл нормальное saline в тканях легких и гомогенизации их, используя параметр ранее протестированных на электронных гомогенизатор, который полностью разрушает легочную ткань не нарушая бактерий. Отрегулируйте общий объем легких огневки до 1 мл и пластины 100 мкл легких lysate на плиты агара Pseudomonas изоляции на десятикратного серийных разведений.
7. Инкубировать пластины при 37 ° C в течение 24 часов и рассчитывать бактериальных колоний для определения кое за весь легких.

6. Статистический анализ

1. Используйте студента t-тест для определения статистической значимости различий между двумя группами. Рассмотреть статистически значимой разницы когда p < 0,05. Все данные представлены как средства ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM).

Результаты

Мы впервые провели эксперимент, чтобы анализировать фагоцитоза, мышь первичной AMs. На протяжении всех анализов мы сравнили AMs, изолированные от WT и TRIM72^KO мышей. Как показано на рис. 1А, микроскопии флуоресцирования показал что фагоцитоза FITC...

Обсуждение

При выполнении функции обмена газа, легких упорно противостоит посторонних частиц, патогенов и аллергенов. АПП обеспечивают первую линию обороны в силу их основная функция, а именно фагоцитоза. АПП также координировать с другими иммунные клетки в уничтожении патогенных микроорганизм?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade