Phagocytose des macrophages alvéolaires et dégagement de bactéries chez la souris

Résumé

Nous rapportons ici les méthodes courantes pour analyser la fonction phagocytaire des macrophages alvéolaires murines et clairance bactérienne du poumon. Ces méthodes d’étudient de la phagocytose des perles de l’isothiocyanate de fluorescéine in vitro et in vivo phagocytose de Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. On décrit également une méthode de dégagement de P. aeruginosa chez la souris.

Résumé

Les macrophages alvéolaires (AMs) gardent l’espace alvéolaire des poumons. Phagocytose par AMs joue un rôle essentiel dans la défense contre l’invasion des agents pathogènes, l’élimination des cellules mortes ou des particules étrangères et dans la résolution des réactions inflammatoires et le remodelage des tissus, des processus qui sont véhiculées par les différents récepteurs de surface l’AMs. Nous rapportons ici les méthodes pour l’analyse de la fonction phagocytaire des AMs à l’aide d’essais in vitro et in vivo et stratégies expérimentales de différencier entre les récepteurs de reconnaissance de pattern - récepteur complément- et Fc gamma médiée par les récepteurs phagocytose. Finalement, nous discutons une méthode afin d’établir et de caractériser un modèle de pneumonie P. aeruginosa chez la souris afin d’évaluer la clairance bactérienne in vivo. Ces tests représentent les méthodes les plus courantes pour évaluer les fonctions AM et peuvent également être utilisés pour étudier la fonction des macrophages et la clairance bactérienne dans d’autres organes.

Introduction

AMs sont les principaux phagocytes résidents dans les alvéoles à l’étape de repos et l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire innée grâce à la reconnaissance et l’internalisation des pathogènes inhalés et particules étrangères^1,2. Il a été rapporté que AMs sont essentiels pour le dédouanement rapid de nombreux pathogènes pulmonaires telles que P. aeruginosa et Klebsiella pneumonie^3,4, donc une carence dans la phagocytose AM aboutit souvent à des voies respiratoires infections, telles que la pneumonie aiguë, entraînant des taux plus élevés de mortalité et de morbidité.

AMs aussi initier des réactions inflammatoires innées dans le poumon par la production de cytokines et chimiokines, comme le TNF-α et IL-1β, les interférences avec d’autres cellules de l’environnement alvéolaire pour produire des chimiokines et recruter inflammatoires polynucléaires neutrophiles, monocytes, et cellules immunitaires adaptatives dans le poumon⁵. Par exemple, IL-1β produites par AMs contribue à amorcer la libération de la chimiokine neutrophile CXCL8 des cellules épithéliales⁶. En outre, AMs contribuent à la phagocytose d’apoptotic polynucléaires (PN), échec de ce qui conduit à la fuite soutenue des enzymes intracellulaires de l’APF aux tissus environnants, ce qui entraîne des lésions tissulaires et inflammation prolongée ^{7 , 8 , 9}.

Phagocytose de l’AMs est médiée par une reconnaissance directe de profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés à la surface de l’agent pathogène par les récepteurs de reconnaissance de modèle (SDRP) de l’AMs ou par la liaison des pathogènes opsonisées avec les récepteurs immunitaires effecteurs de l’AMs ¹⁰. pour ces derniers, AMs peuvent reconnaître les objectifs opsonized avec les immunoglobulines (IgG) par le biais de leurs récepteurs Fcγ (FcγR) ou les agents pathogènes enduits avec des fragments du complément, C3b et C3bi, par le biais de leurs récepteurs de complément (CR)¹¹. Parmi les récepteurs du complément, le CR de la superfamille des immunoglobulines (CRIg) est exprimé sélectivement dans des macrophages de tissu¹², et une découverte récente a mis en évidence le rôle de la CRIg phagocytose AM dans le contexte de la pneumonie P. aeruginosa ¹³.

Plusieurs études originales utilisent des méthodes pour évaluer la phagocytose des macrophages pour décrire les mécanismes moléculaires du macrophage function^14,15. Cependant, les méthodes comme in vivo la phagocytose nécessitent une quantification précise de phagocytose. Nous résumons ici, une méthodologie détaillée pour phagocytose in vitro et in vivo à l’aide de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-microbilles de verre et P. aeruginosa vert fluorescent protein (GFP), respectivement. En outre, nous expliquer la méthode de différenciation entre PRR-, CR- et phagocytose médiée par les FcγR. Enfin, nous présentons une méthode pour caractériser la clairance bactérienne chez la souris par rapport à P. aeruginosa pneumonie.

Protocole

Ce protocole suit les directives de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Eastern Virginia Medical School.

1. fluorescent perles phagocytose

1. Euthanasier la souris (C57BL/6J, âgés de 6 semaines femelle) de CO₂ asphyxie selon les protocoles IACUC pour l’euthanasie éthique des animaux.
2. Poser la ventre de la souris sur une planche de dissection, couverte avec du papier absorbant. Cerner ses pattes avec ses membres tout et accrocher une chaîne sous ses dents avant de tirer sa tête arrière de façon que la trachée est positionnée directement et niveau.
3. Mouiller la gorge, poitrine et ventre avec de l’éthanol 70 % pour désinfecter et pour éviter que la fourrure n’attachent aux outils de la souris.
4. À l’aide de forceps ordinaire, tirer vers le haut de la ligne médiane du corps, la peau et couper avec des ciseaux chirurgicaux vers le haut de l’axe central vers le haut de la gorge.
5. À l’aide de l’extrémité arrondie des ciseaux chirurgicaux standard, soigneusement s’éloigner les muscles et les tissus conjonctifs, sur la gorge et utiliser des ciseaux de printemps (microciseaux) pour exposer la trachée.
6. Saisissant un anneau de cartilage avec la pince, soigneusement faire une petite incision (~1.5 mm), à l’aide de microciseaux, sur le visage de ventricule de la trachée et insérer une canule de 18 G dans la trachée.
7. Doucement lavage 3 mL de tampon phosphate salin (PBS), 1 mL à la fois. Chaque fois retirer doucement le liquide dans la seringue et le refaire à nouveau dans le poumon, 3 x de suite. Après avoir recueilli la BALF, effectuer la dislocation cervicale pour s’assurer de l’euthanasie. Transférer le PBS collecté (~2.8 mL), qui est le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA), dans un tube, centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min et recueillir le culot. Ajouter 1 mL de PBS frais dans le tube et centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min laver les débris et recueillir les macrophages alvéolaires granulés.
8. Resuspendre le culot dans 2 mL de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % non inactivés bovine sérum fœtal (SVF) et les macrophages alvéolaires principale culture dans les médias mêmes pour 2 jours sur un plat de fond en verre à 37 ° C en atmosphère humidifiée.
9. Aspirer les anciens médias, lavez-le avec 1 mL de PBS et ajouter 2 mL de supports neufs. Ajouter les perles FITC (billes de latex carboxylé, 2 µm de diamètre, 50 perles/cellule) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C en atmosphère humidifiée.
10. Laver abondamment avec du PBS (1 mL à la fois, pour un total de cinq lavages) pour enlever les cordons extracellulaires. Image 100 cellules au hasard et de compter les cellules avec des perles intracellulaires (488 nm).
    NOTE : phagocytaire index sont le nombre de perles ingérés divisé par le nombre total des macrophages ; le pourcentage de cellules phagocytaires est le nombre de macrophages qui ingèrent au moins une bille divisée par le nombre total de macrophages¹⁶.
    1. Sinon, après une incubation de 1 h avec perles, laver les cellules avec 3 mL de PBS et les traiter pour cytométrie de flux pour la quantification de la phagocytose. Traiter de la même façon, AMs sans billes colorées ou non de cellules ou cellules témoins. Calculer la pourcentage de positivité et moyenne intensité de fluorescence, à l’aide de logiciels de cytométrie en flux, en sélectionnant ces options dans le logiciel.

2. FcγR et CR-médiée par phagocytose

1. Pour l’opsonisation, incuber⁸ 2 x 10 moutons culots globulaires (SRBCs) avec 50 µL de lapin anti-IgM-SRBC ou 50 µL de lapin anti-SRBC-IgG pendant 30 min à température ambiante,¹¹.
2. Incuber les IgM-opsonized SRBCs avec 50 µL de sérum humain déficient en C5 (C5D) pendant 30 min à 37 ° C pour fixer les fragments du complément C3b et C3bi sur IgM-enduit SRBCs.
3. Graines de macrophages de souris (cellules MH-S) (10 000 cellules/puits) dans une plaque à 96 puits et incuber pendant la nuit pour obtenir une confluence d’environ 70 %. Ajouter 100 µL de 1 x 107/ml opsonized SRBCs dans chaque loge de cellules MH-S et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Lavage non consolidé SRBCs très rapidement (~ 1 min) avec 100 µL de tampon de lyse de chlorure d’ammonium-potassium (ACK).
4. Lyser les cellules avec du SDS 0,1 % et ajouter 50 µL de 2,7-diaminofluorene (DAF) contenant du peroxyde d’hydrogène 3 % et de l’urée 6 M. Mesurer l’absorbance de la formation de l’hémoglobine catalyse fluorène bleu à 620 nm.
5. Déterminer le nombre de SRBCs en utilisant une courbe d’étalonnage à 620 valeurs d’absorbance de nm avec un nombre connu de SRBCs. De même, processus MH-S cellules incubées avec nonopsonized SRBCs à utiliser comme témoins négatifs.

3. PRR médiée par phagocytose

1. Suivez les étapes 1.1-1,9 pour l’isolement et culture des macrophages alvéolaires primaire de souris.
2. Après 2 jours, retirez le support, laver les cellules avec 1 mL de PBS et ajouter 500 µL de milieux frais contenant Alexa Fluor-488-conjugué zymosan-A bioparticules (100 particules/plat).
3. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Arrêtez la phagocytose en ajoutant 500 µL de PBS glacée.
4. Laver les cellules abondamment avec du PBS (1 mL à la fois, pour un total de cinq lavages). Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 10 min à température ambiante.
5. Laver les cellules abondamment avec du PBS (1 mL à la fois, pour un total de cinq lavages) et maintenir les cellules en 500 µL de PBS.
6. Image de cellules dans le contraste interférentiel différentiel et un canal fluorescent à 488 nm. Compter les AMs contenant zymosan-a bioparticules et détermine le pourcentage de phagocytose.

4. in Vivo la phagocytose par les Macrophages alvéolaires

NOTE : Ensemencer de P. aeruginosa GFP sur une gélose nutritive et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain, ensemencer la seule colonie à 2 mL de bouillon nutritif et cultiver les bactéries à 37° C pendant la nuit.

1. Le lendemain, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de xylazine kétamine et 10 mg/kg de 100 mg/kg. Confirmer le bonne anesthetization par une absence de réponse pour le pincement de l’orteil.
2. Posez la souris sur une planche à plate avec un élastique entre les incisives supérieures et le placer dans une position semi-couchée (45°) avec la face ventrale et la tribune vers le haut. Avec une pincette courbée, rétracter partiellement la langue. À l’aide d’un microsprayer, par voie intratrachéale administrer 50 µL (5 x 10⁶ unités formant des colonies [UFC])¹⁷ P. aeruginosa GFP dans les poumons des souris anesthésiés.
3. Après 1 h d’infection, suivez les étapes 1.1 à 1.7.
4. Remettre en suspension les cellules dans du PBS et cytocentrifuge eux (1 000 x g, 1 min à température ambiante) sur une lame de verre.
5. Différentiellement tacher les diapositives cytospin pour les macrophages alvéolaires, les neutrophiles et les lymphocytes, selon les instructions du fabricant.
6. Au hasard sélectionner 100 MGS, compter la MGS contenant des bactéries intracellulaires et détermine le pourcentage de phagocytose.

5. in Vivo à l’aide de la clairance de bactéries de P. aeruginosa

1. Ensemencer de P. aeruginosa sur une gélose P. aeruginosa isolement et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Ensemencer la seule colonie à 2 mL de bouillon de lysogénie (LB) et pousser les bactéries à 37° C pendant la nuit. Calculer l’UFC, à l’aide de la formule suivante.
   
   UFC/mL = (nombre de colonies x facteur de dilution) / volume de la plaque de culture.
   
   Diluer la culture avec PBS pour obtenir le désiré CFU/mL.
2. Dans l’essai 1, par voie intratrachéale injecter une dose de ~2.5 x 10⁵ UFC/mL de P. aeruginosa anesthésié sauvage (WT) et TRIM72 souris^KO , comme indiqué à l’étape 4.2. Mesurer le poids corporel par jour pendant 6 jours.
3. En première instance 2, injecter une deuxième dose P. aeruginosa (5 x 10⁵ UFC/mL) dans les souris qui ont survécu à l’essai 1 et mesurent le poids de corps pendant 4 jours.
4. Dans l’essai 3, en utilisant un ensemble différent de souris, injecter WT et TRIM72 souris^KO avec une dose létale (3 x 10⁷ UFC/mL) de P. aeruginosa et enregistrer le taux de mortalité dans les 2 jours d’injection. Les animaux présentant des signes de stress sévère comme la perte de poids significative, dos voûté, anorexie ou dyspnée sera évaluée par le vétérinaire traitant. Incurable animaux est sacrifiés immédiatement.
5. Au moment du décès ou après l’euthanasie au 2e jour après l’injection, recueillir le tissu de poumon entier pour la quantification de la charge bactérienne pulmonaire infection pic.
6. Pour tester la charge bactérienne, ajouter 200 µL de sérum physiologique dans les tissus pulmonaires et homogénéiser, utilisant un paramètre précédemment testé sur un homogénéisateur électronique qui perturbe complètement le tissu pulmonaire sans casser les bactéries. Réglez le volume total de l’homogénat de poumon à 1 mL et plaque 100 µL de poumon lysat sur les boîtes de gélose d’isolement de Pseudomonas à 10 fois des dilutions successives.
7. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h et compter les colonies bactériennes pour déterminer l’UFC / poumon entier.

6. analyse statistique

1. Utiliser de Student t-test pour déterminer la signification statistique de la différence entre les deux groupes. Envisager une différence statistiquement significative quand p < 0,05. Toutes les données sont présentées comme le moyen ± écart-type de la moyenne (SEM).

Résultats

Nous avons tout d’abord réalisé l’expérience pour analyser la phagocytose de souris primaires AMs. Tout au long de toutes les analyses, nous avons comparé les AMs isolées des souris^KO de WT et TRIM72. Comme illustré dans la Figure 1A, microscopie à fluorescence a révélé que la phagocytose des perles de verre-FITC de souris primaires AMs survient après 1 h d’incubation. Figure 1

Discussion

Tout en remplissant une fonction d’échange de gaz, le poumon confronte constamment allergènes, pathogènes et les particules étrangères. AMs fournissent la première ligne de défense en raison de leur fonction principale, à savoir la phagocytose. AMs est également coordonnent avec d’autres cellules de système immunitaires à détruire les agents pathogènes et la résolution de l’inflammation. Ici, nous avons décrit les méthodes permettant d’évaluer plus précisément la phagocytose par AMs isolé par ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade