Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.

Zusammenfassung

Alveoläre Makrophagen (AMs) bewachen den alveolären Raum der Lunge. Phagozytose durch AMs spielt eine entscheidende Rolle bei der Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger, die Entfernung von abgestorbenen Zellen oder Fremdkörper, und bei der Lösung von Entzündungsreaktionen und Umbau-Gewebe verarbeitet, die durch verschiedene Oberflächen-Rezeptoren vermittelt werden Das AMs. Hier berichten wir über Methoden zur Analyse der phagocytic Funktion des AMs mit in-vitro- und in-vivo-Tests und experimentelle Strategien um zu unterscheiden, die Muster-Anerkennung-Rezeptor - Komplement-Rezeptor- und Fc-Gamma-Rezeptor-vermittelten Phagozytose. Schließlich diskutieren wir eine Methode zu etablieren und zu charakterisieren ein p. Aeruginosa Lungenentzündung Modell bei Mäusen zu in-vivo bakterielle Abstand beurteilen. Diese Tests sind die am häufigsten verwendeten Methoden, AM Funktionen zu bewerten und können auch zur Funktion der Makrophagen und bakterielle Spiel in andere Organe zu studieren.

Einleitung

AMs sind die wichtigsten Residenten Fresszellen in die Alveolen in der Ruhephase und einer der Hauptakteure der angeborenen Immunantwort durch die Anerkennung und Internalisierung der eingeatmete Krankheitserreger und Fremdkörper^1,2. Es wurde berichtet, dass AMs unerlässlich für die schnelle Abfertigung von vielen pulmonale Krankheitserreger wie p. Aeruginosa und Klebsiella Pneumonie^3,4, sind also ein Mangel an AM Phagozytose oft in die Atemwege führt Infektionen, wie z. B. akute Lungenentzündung, die höhere Mortalität und Morbidität führen.

AMs initiieren auch angeborene Entzündungsreaktionen in der Lunge durch die Herstellung Zytokine und Chemokine wie TNF-α und IL-1β, welche Übersprechen mit anderen Zellen der alveolären Umwelt produzieren Chemokine und entzündliche Neutrophilen, Monozyten, rekrutieren und Adaptive Immunzellen in der Lunge⁵. Zum Beispiel hilft IL-1β von AMs produziert die Freisetzung von Neutrophilen Chemokin CXCL8 aus Epithelzellen⁶Prime. Darüber hinaus tragen AMs zur Phagozytose des apoptotischen polymorphkernige Leukozyten (PMNs), was dazu führt, das nachhaltige Austreten von intrazellulären Enzyme von PMNs Nichtbeachtung umliegendes Gewebe, wodurch Gewebeschäden und längerer Entzündung ^{7 , 8 , 9}.

Phagozytose durch das AMs wird durch eine direkte Anerkennung der Pathogen-assoziierte molekulare Muster auf der Oberfläche der Erreger durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) des AMs oder durch die Bindung von opsonized Krankheitserreger mit immun-Effektor-Rezeptoren des AMs vermittelt. ¹⁰. für Letzteres AMs erkennt die Ziele mit Immunglobulin (IgG) opsonized durch ihre Fcγ Rezeptoren (FcγR) oder die Erreger beschichtet mit Ergänzung Fragmente, C3b und C3bi, durch deren Komplement-Rezeptoren (CR)¹¹. Unter Ergänzung Rezeptoren die CR die Immunglobulin-Superfamilie (CRIg) drückt sich selektiv im Gewebe Makrophagen¹²und den letzten Feststellung hob die Rolle der CRIg in AM Phagozytose im Zusammenhang mit p. Aeruginosa Lungenentzündung ¹³.

Viele Originalstudien verwenden Methoden, um Makrophagen Phagozytose um zu beschreiben, die molekularen Mechanismen der Makrophagen Funktion^14,15zu bewerten. Methoden wie in-vivo Phagozytose erfordern jedoch eine präzise Quantifizierung der Phagozytose. Hier fassen wir eine detaillierte Methode für in-vitro- und in-vivo Phagozytose mit Fluorescein erfolgt (FITC)-Glas Perlen und p. Aeruginosa grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beziehungsweise. Darüber hinaus erläutern wir die Methode der Unterscheidung zwischen PRR, CR und FcγR vermittelt Phagozytose. Zu guter Letzt berichten wir über eine Methode, um bakterielle Clearance bei Maus in Bezug auf p. Aeruginosa Lungenentzündung zu charakterisieren.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Eastern Virginia Medical School.

(1) fluoreszierenden Perlen Phagozytose

1. Die Maus einschläfern (C57BL/6J, 6 Wochen alt, weiblich) durch CO₂ ersticken nach IACUC Protokolle für die ethische Euthanasie von Tieren.
2. Legen Sie die Maus Belly-up auf eine Dissektion Board mit Küchenpapier bedeckt. Festzunageln Sie seine Pfoten mit seinen Gliedmaßen Spread-Eagle und Haken Sie eine Zeichenfolge unter seine Vorderzähne, seinen Kopf zurück, so dass die Luftröhre gerade ausgerichtet ist und Niveau.
3. Nass, Kehle, Brust und Bauch mit 70 % Ethanol zur Desinfektion und verhindern, dass das Fell kleben an den Werkzeugen der Maus.
4. Mit regelmäßigen Pinzette, ziehen Sie die Haut an der Mittellinie des Körpers, und schneiden mit chirurgische scheren sich die Mittellinie an die Spitze der Kehle.
5. Mit dem stumpfen Ende standard Chirurgische Scheren, sorgfältig wegziehen von Muskel- und Bindegewebe an der Kehle und Feder Schere (Microscissors) verwenden, um die Luftröhre aussetzen.
6. Einen Knorpel-Ring mit der Zange greifen, sorgfältig machen Sie einen kleinen Schnitt (~1.5 mm), mit Microscissors, auf die Herzkammer Gesicht der Luftröhre und legen Sie eine 18 G-Kanüle in der Luftröhre.
7. Sanft Lavage 3 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1 mL zu einem Zeitpunkt. Jedes Mal sanft zurückziehen die Flüssigkeit in der Spritze und beleben ihn zurück in die Lunge, 3 X in Folge. Nach dem Sammeln der BALF, führen Sie durch zervikale Dislokation um Euthanasie zu gewährleisten. Übertragen der gesammelten PBS (~2.8 mL), die alvéolaire Lavage Fluid (BALF) ist, zu einem Schlauch, Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min, und sammeln Sie das Pellet. Am Rohr und Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min waschen den Schmutz und sammeln die gebeizte alveolären Makrophagen fügen Sie 1 mL frisch PBS hinzu.
8. Aufschwemmen Sie das Pellet in 2 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % Nonheat-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und Kultur primäre alveoläre Makrophagen in den gleichen Medien für 2 Tage auf einem Glasboden Teller bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre.
9. Aspirieren Sie die alten Medien, waschen Sie es mit 1 mL PBS, und 2 mL frische Medien. Perlen Sie FITC (Carboxylated Latex Perlen, 2 µm im Durchmesser, 50 Perlen/Zelle) und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre.
10. Waschen Sie ausgiebig mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Wäschen), um extrazelluläre Perlen zu entfernen. Bild 100 Zellen nach dem Zufallsprinzip und zählen Sie die Zellen mit intrazellulären Perlen (488 nm).
    Hinweis: Phagocytic Indizes sind die Anzahl der aufgenommenen Perlen dividiert durch die Gesamtzahl der Makrophagen. der Anteil der phagocytic Zellen ist die Anzahl von Makrophagen, die mindestens eine Perle dividiert durch die Gesamtzahl der Makrophagen¹⁶aufnehmen.
    1. Alternativ nach einer 1 h Inkubation mit Perlen, die Zellen mit 3 mL PBS waschen und für Durchflusszytometrie für die Quantifizierung der Phagozytose zu verarbeiten. In ähnlicher Weise verarbeiten Sie AMs ohne Perlen als ungefärbten Zellen oder Kontrolle. Berechnen Sie die prozentuale Positivität und meine Fluoreszenzintensität, mit Flow Cytometry Software, indem Sie diese Optionen in der Software auswählen.

2. FcγR - und CR-vermittelten Phagozytose

1. Inkubieren Sie für die Opsonization 2 x 10⁸ Schafe roten Blutkörperchen (SRBCs) mit 50 µL Kaninchen Anti-SRBC-IgM oder 50 µL Kaninchen Anti-SRBC-IgG für 30 min bei Raumtemperatur¹¹.
2. Beheben Sie die Ergänzung Fragmente C3b und C3bi auf IgM-beschichtete SRBCs IgM opsonized SRBCs mit 50 µL Humanserum C5-defizienten (C5D) für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
3. Seed murinen Makrophagen Zellen (MH-S) (10.000 Zellen/Na) in eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie es über Nacht um einen Zusammenfluss ~ 70 % zu erhalten. Fügen Sie 100 µL 1 x 10⁷/mL opsonized SRBCs in jede Vertiefung der MH-S Zellen und 1 h bei 37 ° c inkubieren Wash ungebunden SRBCs sehr schnell (~ 1 min) mit 100 µL Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer.
4. Lösen Sie die Zellen mit 0,1 % SDS und fügen Sie 50 µL 2,7-Diaminofluorene (DAF), 3 % Wasserstoffperoxid und 6 M Harnstoff enthält. Messen Sie die Absorption der Hämoglobin-katalysierte Fluorene blau Bildung bei 620 nm.
5. Bestimmen Sie die Anzahl der SRBCs mithilfe einer Standardkurve bei 620 nm Absorption Werte mit einer bekannten Anzahl von SRBCs. In ähnlicher Weise inkubiert Prozess MH-S Zellen mit nonopsonized SRBCs, als negative Kontrollen zu verwenden.

(3) PRR-vermittelten Phagozytose

1. Schritte 1.1-1.9 für die Isolierung und Kultivierung von Maus primäre alveoläre Makrophagen.
2. Entfernen Sie nach 2 Tagen das Medium, die Zellen mit 1 mL PBS waschen und 500 µL frisches Medium mit Alexa Fluor-488-konjugiert Zymosan-A Bioparticles (100 Partikel/Gericht) hinzufügen.
3. 1 h bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Phagozytose durch Zugabe von 500 µL eiskaltem PBS.
4. Waschen Sie die Zellen ausführlich mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Waschungen). Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur.
5. Waschen der Zellen ausführlich mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Wäschen) und halten Sie die Zellen in 500 µL PBS.
6. Bild der Zellen unter differential Interferenz-Kontrast und einem fluoreszierenden Kanal bei 488 nm. Zählen Sie AMs mit Zymosan-A Bioparticles und bestimmen Sie den Prozentsatz der Phagozytose.

4. in Vivo Phagozytose durch alveoläre Makrophagen

Hinweis: p. Aeruginosa GFP auf Nähragar Teller zu impfen und über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren. Am nächsten Tag impfen Sie die einzige Kolonie bis 2 mL der Nährbouillon und wachsen Sie die Bakterien bei 37° C über Nacht.

1. Am nächsten Tag zu betäuben Mäuse mit einem intraperitonealer Verabreichung von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Richtige Anesthetization über eine fehlende Reaktion auf die Zehe Prise zu bestätigen.
2. Legen Sie die Maus auf ein flaches Brett mit einem Gummiband über die oberen Schneidezähne und positionieren Sie es semirecumbent (45°) mit der ventralen Oberfläche und Tribüne nach oben zeigt. Mit gebogenen Pinzette, teilweise zurückziehen der Zungenkrebs. Mit einem Mikrosprayer, Intratracheally 50 µL (5 x 10⁶ Koloniebildenden Einheiten [CFU])¹⁷ von p. Aeruginosa GFP in die Lungen der narkotisierten Mäuse verwalten.
3. Nach 1 h von Infektion Schritte 1,1-1,7.
4. Aufschwemmen der Zellen in PBS und Cytocentrifuge sie (1.000 X g, 1 min bei Raumtemperatur) auf einen Objektträger.
5. Differentiell Fleck der Cytospin Folien für alveolären Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
6. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 100 AMs, zählen Sie das AMs, die intrazelluläre Bakterien, und den Prozentsatz der Phagozytose.

5. in Vivo Bakterien Clearance mittels p. Aeruginosa

1. P. Aeruginosa auf eine Agarplatte p. Aeruginosa Isolierung zu impfen und über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren. Impfen Sie die einzige Kolonie bis 2 mL Lysogeny Brühe (LB) zu und wachsen Sie die Bakterien bei 37° C über Nacht. Berechnen Sie die KBE, mithilfe der folgenden Formel.
   
   KBE/mL = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / Volumen der Kultur-Platte.
   
   Die Kultur mit PBS der gewünschten KBE/mL zu verdünnen.
2. In Studie 1 Intratracheally injizieren eine subletale Dosis von ~2.5 X 10⁵ KBE/mL p. Aeruginosa in narkotisierten Wildtyp (WT) und TRIM72^KO Mäusen, wie in Schritt 4.2 angegeben. Messen Sie das Körpergewicht täglich für 6 Tage.
3. Spritzen Sie in Studie 2 eine zweite Dosis von p. Aeruginosa (5 x 10⁵ KBE/mL) in die Mäuse, die in Studie 1 überlebt und das Körpergewicht für 4 Tage zu messen.
4. Injizieren Sie in Studie 3, einen anderen Satz von Mäusen WT und TRIM72^KO Mäusen mit einer tödlichen Dosis (3 x 10⁷ KBE/mL) von p. Aeruginosa zu und erfassen Sie die Sterblichkeit innerhalb 2 Tagen nach der Injektion. Tiere Anzeichen von schweren Belastungen, wie bedeutende Körper-Gewicht-Verlust, wird durch die behandelnden Tierärzte Rundrücken, Magersucht oder Dyspnoe beurteilt werden. Sofort werden unheilbar Tiere geopfert werden.
5. Bei Tod oder nach Euthanasie am 2. Tag nach der Injektion sammeln Sie das ganze Lungengewebe für die Quantifizierung der Lunge bakterielle Belastung am Gipfel Infektion.
6. Um die bakterielle Belastung der Lunge zu testen, das Lungengewebe 200 µL des normalen Kochsalzlösung hinzu und homogenisieren sie, mit einer zuvor getesteten Einstellung auf eine elektronische Homogenisator, die völlig das Lungengewebe stört ohne Bakterien. Passen Sie das Gesamtvolumen der Lunge Homogenat zu 1 mL und Platte 100 µL der Lunge lysate auf Pseudomonas isoliert Agarplatten bei 10-divisibel serielle Verdünnungen.
7. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h und zählen Sie die Bakterienkolonien um die KBE pro ganze Lunge festzustellen.

6. statistische Analyse

1. Verwenden des Student t-Test, um die statistische Signifikanz der Differenz zwischen den beiden Gruppen festzustellen. Einen Unterschied als statistisch signifikant überlegen p < 0,05. Alle Daten werden dargestellt als ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) bedeutet.

Ergebnisse

Zuerst führten wir das Experiment zu analysieren, Phagozytose per Mausklick primäre AMs. Während alle Analysen verglichen wir AMs von WT und TRIM72^KO Mäusen isoliert. Wie in Abbildung 1Adargestellt, offenbart Fluoreszenz-Mikroskopie die Phagozytose von FITC-Glasperlen von Maus primären AMs tritt nach 1 h Inkubation. Abbildung 1 B zeigt die Auswertung der Phagozytose durch Durchflu...

Diskussion

Während der Durchführung einer Gas-Austausch-Funktion, konfrontiert die Lunge anhaltend Fremdkörper, Krankheitserreger und Allergene. AMs bieten die erste Linie der Verteidigung aufgrund ihrer wichtigsten Funktion, nämlich Phagozytose. AMs auch mit anderen Immunzellen in der Krankheitserreger zu zerstören und die Auflösung der Entzündung zu koordinieren. Hier beschrieben wir Methoden zur Bewertung der speziell Phagozytose durch AMs isoliert von der Maus-Lunge. Das Protokoll präsentiert in diesem Manuskript erklä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade