Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

Resumo

Aqui nós relatamos métodos comuns para analisar a função fagocitária de macrófagos alveolares murino e apuramento bacteriano do pulmão. Esses métodos estudam in vitro fagocitose dos grânulos de isotiocianato de fluoresceína e fagocitose in vivo de Pseudomonas aeruginosa verde proteína fluorescente. Também descrevemos um método para limpar p. aeruginosa em camundongos.

Resumo

Macrófagos alveolares (AMs) guardam o espaço alveolar do pulmão. Fagocitose por AMs tem um papel fundamental na defesa contra a invasão de agentes patogénicos, a remoção de células mortas ou partículas estranhas e na resolução de respostas inflamatórias e remodela o tecido, processos que são mediadas por diversos receptores de superfície de o AMs. Aqui, nós relatamos métodos para a análise da função fagocitária do AMs usando estratégias experimentais e ensaios in vitro e in vivo para diferenciar os receptores de reconhecimento padrão-, complemento do receptor e gama Fc mediada fagocitose. Finalmente, discutimos um método para estabelecer e caracterizar um modelo de uma pneumonia de p. aeruginosa em camundongos para avaliar bacteriana liberação in vivo. Estes ensaios representam os métodos mais comuns para avaliar funções AM e também podem ser usados para estudar a função de macrófagos e liberação bacteriana em outros órgãos.

Introdução

MGA é os principais fagócitos residentes no alvéolo na fase de repouso e um dos principais players de inatas respostas imunes através do reconhecimento e internalização dos patógenos inalados e partículas estranhas^1,2. Tem sido relatado que AMs são essenciais para a habilitação rápida de muitos patógenos pulmonares tais como p. aeruginosa e Klebsiella pneumonia^3,4, por uma deficiência na fagocitose AM muitas vezes resulta em respiratória infecções, como pneumonia aguda, que causam maiores taxas de mortalidade e morbidade.

AMs também iniciar inatas respostas inflamatórias no pulmão através da produção de citocinas e quimiocinas como TNF-α e IL-1 β, que conversa cruzada com outras células do ambiente alveolar para produzir quimiocinas e recrutar inflamatórios neutrófilos, monócitos, e células do sistema imunológico adaptativas no pulmão⁵. Por exemplo, a IL-1 β, produzido por AMs ajuda a prime a liberação do neutrófilos chemokine CXCL8 de células epiteliais⁶. Além disso, AMs contribuam para a fagocitose de apoptotic leucócitos polimorfonucleares (PMN), falha de que leva para o escapamento sustentado de enzimas intracelulares de PMN ao tecido circundante, resultando em danos nos tecidos e inflamação prolongada ^{7 , 8 , 9}.

Fagocitose por AMs é mediada por um reconhecimento direto de padrões moleculares associados patógeno na superfície do patógeno pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs) do AMs ou pela ligação de patógenos opsonized com receptores efetoras imune da AMs ¹⁰. por último, AMs podem reconhecer os alvos opsonizados com imunoglobulina (IgG) através de seus receptores Fcγ (FcγR) ou os patógenos revestidos com fragmentos de complemento, C3b e C3bi, através de seus receptores de complemento (CR)¹¹. Entre receptores de complemento, o CR da superfamília imunoglobulina (CRIg) seletivamente é expresso em macrófagos de tecido¹², e uma recente descoberta destacou o papel do CRIg na fagocitose do AM no contexto de pneumonia de p. aeruginosa ¹³.

Muitos estudos originais usam métodos para avaliar a fagocitose de macrófagos para descrever os mecanismos moleculares do macrófago função^14,15. No entanto, métodos como fagocitose in vivo requerem uma quantificação exacta da fagocitose. Aqui, podemos resumir uma metodologia detalhada para a fagocitose in vitro e in vivo usando o isotiocianato de fluoresceína (FITC)-pérolas de vidro e proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Além disso, vamos explicar o método de diferenciação entre PRR, CR e fagocitose mediada por FcγR. Finalmente, nós relatamos um método para caracterizar o apuramento bacteriano no mouse no que diz respeito uma pneumonia de p. aeruginosa .

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da faculdade de medicina de Virgínia Oriental.

1. fluorescente grânulos fagocitose

1. Eutanásia o mouse (C57BL/6J, 6 semanas de idade, sexo feminino) por CO₂ asfixia conforme protocolos IACUC para a ética eutanásia de animais.
2. Coloque o mouse de barriga para cima em um tabuleiro de dissecação, coberto com toalhas de papel. Segure as patas com seus membros abertos e ligar uma cadeia de caracteres em seus dentes da frente para puxar sua cabeça de volta para que a traqueia está posicionada em linha reta e nível.
3. Molhe a garganta, peito e barriga com etanol a 70% para desinfetar e evitar as peles de degola para as ferramentas do rato.
4. Usando pinças regulares, puxe a pele na linha central do corpo e corte com tesoura cirúrgica acima da linha central para a parte superior da garganta.
5. Usando a extremidade sem corte de tesoura cirúrgica padrão, cuidadosamente afastar os músculos e tecidos conectivos na garganta e usar tesouras de primavera (micro-tesouras) para expor a traqueia.
6. Segurando um anel de cartilagem com a pinça, cuidadosamente faça uma pequena incisão (~1.5 mm), utilizando micro-tesouras, na face da traqueia de ventrículo e introduza uma cânula de 18 G na traqueia.
7. Delicadamente lavagem 3 mL de tampão fosfato salino (PBS), 1 mL de cada vez. Cada vez que retirar delicadamente o líquido na seringa e reinfuse-lo de volta para o pulmão, 3x na sucessão. Depois de coletar a LBA, realize deslocamento cervical para garantir a eutanásia. Transfira a PBS coletada (~2.8 mL), que é o líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), para um tubo, centrifugar a 1.000 x g por 10 min e coletar o sedimento. Adicione 1 mL de PBS fresco para o tubo e centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos lavar os detritos e coletar os macrófagos alveolares peletizados.
8. Resuspenda o pellet em 2 mL do meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% inactivadas nonheat fetal de soro bovino (FBS) e cultura primária macrófagos alveolares na mesma mídia para 2 dias em um prato de vidro-inferior a 37 ° C numa atmosfera umidificada.
9. Aspire a velha mídia, lave-a com 1 mL de PBS e adicionar 2 mL de mídia fresca. Adicionar contas FITC (decapeptídeo látex grânulos, 2 µm de diâmetro, 50 contas/celular) e incubar durante 1 h a 37 ° C numa atmosfera umidificada.
10. Lave extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens) para remover contas extracelulares. Imagem 100 células aleatoriamente e contar as células com grânulos intracelulares (488 nm).
    Nota: índices Phagocytic são o número de grânulos ingeridos, dividido pelo número total de macrófagos; a percentagem de células fagocíticas é o número de macrófagos que ingerir pelo menos um grânulo dividido pelo número total de macrófagos¹⁶.
    1. Alternativamente, após uma incubação de 1 h com miçangas, lavam-se as células com 3 mL de PBS e processá-los por citometria de fluxo para a quantificação de fagocitose. Da mesma forma, o processo AMs sem grânulos como células imaculadas ou controle. Calcular a percentagem de positividade e dizer a intensidade da fluorescência, utilizando software de citometria de fluxo, selecionando as opções no software.

2. FcγR e CR-mediada por fagocitose

1. Para a opsonização, incube 2 x 10⁸ ovelhas células vermelhas do sangue (SRBCs) com 50 µ l de coelho anti-SRBC-IgM ou 50 µ l de coelho anti-SRBC-IgG por 30 min em temperatura¹¹.
2. Incube SRBCs IgM-opsonizada com 50 µ l de soro humano C5-deficiente (C5D) por 30 min a 37 ° C para corrigir os fragmentos do complemento C3b e C3bi na SRBCs IgM-revestido.
3. Murino macrófagos células (MH-S) da semente (10.000 células/poço) em uma placa de 96 poços e incubar durante a noite para obter uma confluência de ~ 70%. Adicione 100 µ l de 1 x 10⁷/mL opsonizada SRBCs a cada poço das células MH-S e incubar durante 1 h a 37 ° C. Lavagem sem uma ligação SRBCs muito rapidamente (~ 1 min) com 100 µ l de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK).
4. Lisar as células com SDS 0,1% e adicionar 50 µ l de 2,7-diaminofluorene (DAF) contendo 3% de peróxido de hidrogênio e ureia 6m. Medir a absorvância da formação de hemoglobina-catalisada fluorene azul a 620 nm.
5. Determine o número de SRBCs por meio de uma curva padrão em valores de absorvância 620 nm com um número conhecido de SRBCs. Da mesma forma, o processo MH-S células incubadas com nonopsonized SRBCs para usar como controles negativos.

3. PRR mediada por fagocitose

1. Siga os passos 1.1-1.9 para o isolamento e cultivo de macrófagos alveolares primário de rato.
2. Depois de 2 dias, remova a mídia, lavam-se as células com 1 mL de PBS e adicione 500 µ l de mídia fresca contendo bioparticles de ZnPPIX-A Alexa Fluor-488-conjugado (100 partículas/prato).
3. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Pare a fagocitose adicionando 500 µ l de PBS gelado.
4. Lave as células extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens). Fixe as células com paraformaldeído 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente.
5. Lavar as células extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens) e manter as células em 500 µ l de PBS.
6. Imagem as células sob contraste de interferência diferencial e um canal fluorescente em 488 nm. Contar AMs contendo ZnPPIX-A bioparticles e determinar a porcentagem de fagocitose.

4. in Vivo a fagocitose por macrófagos alveolares

Nota: Inocular a p. aeruginosa GFP em uma placa de ágar nutriente e incubar a placa a 37 ° C durante a noite. No dia seguinte, inocular a colônia única a 2 mL de caldo nutriente e crescer a bactéria a 37° C durante a noite.

1. No dia seguinte, anestesia os ratos com uma administração intraperitoneal de 100 mg/kg quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Confirme anesthetization adequada através de uma falta de resposta para o aperto de dedo do pé.
2. Coloque o mouse sobre uma placa plana com um elástico entre os incisivos superiores e coloque-o numa posição semirecumbente (45°) com a superfície ventral e rostro virado para cima. Usando a pinça curvada, parcialmente retrai a língua. Usando um microsprayer, intratraquealmente administrar 50 µ l (5 x 10⁶ formadoras unidades [CFU])¹⁷ de p. aeruginosa GFP para os pulmões dos ratos anestesiados.
3. Após 1 h de infecção, siga os passos 1.1-1.7.
4. Ressuspender as células em PBS e cytocentrifuge-los (1.000 x g, 1 min à temperatura ambiente) numa lâmina de vidro.
5. Diferencialmente manche os slides cytospin para macrófagos alveolares, neutrófilos e linfócitos, de acordo com as instruções do fabricante.
6. Selecione 100 AMs aleatoriamente, contar o AMs contendo bactérias intracelulares e determinar a porcentagem de fagocitose.

5. in Vivo bactérias autorização usando p. aeruginosa

1. Inocular a p. aeruginosa em uma placa de ágar de isolamento de p. aeruginosa e incubar a placa a 37 ° C durante a noite. Inocular a colônia única a 2 mL de caldo lisogenia (LB) e crescer a bactéria a 37° C durante a noite. Calcule o UFC, usando a seguinte fórmula.
   
   UFC/mL = (número de colônias x fator de diluição) / volume da placa de cultura.
   
   Dilua a cultura com PBS para obter o desejado UFC/mL.
2. No 1º julgamento, intratraquealmente injetar uma dose subletais de ~2.5 x 10⁵ UFC/mL de p. aeruginosa anestesiado selvagem-tipo (WT) e TRIM72 ratos^KO , tal como indicado no passo 4.2. Medir o peso corporal diariamente por 6 dias.
3. No teste 2, injete uma segunda dose de p. aeruginosa (5 x 10⁵ UFC/mL) os ratos que sobreviveram no 1º julgamento e medem o peso de corpo por 4 dias.
4. No 3º julgamento, usando um conjunto diferente de ratos, injectar WT e TRIM72^KO ratos com uma dose letal (3 x 10⁷ UFC/mL) de p. aeruginosa e registar a mortalidade dentro de 2 dias de injeção. Animais apresentando sinais de estresse severo, como perda de peso significativa do corpo, costas encurvada, anorexia ou dispneia será avaliada por veterinários a atendente. Intratáveis animais serão sacrificados imediatamente.
5. Morte ou após eutanásia no 2º dia após a injeção, colete tecido pulmonar-todo para a quantificação da carga bacteriana pulmonar na infecção de pico.
6. Para testar a carga bacteriana do pulmão, adicionar 200 µ l de solução salina para os tecidos do pulmão e homogeneizar a eles, usando uma configuração previamente testada em um homogeneizador eletrônico que interrompe completamente o tecido pulmonar sem quebrar as bactérias. Ajuste o volume total do pulmão homogenate de 1ml e placa 100 µ l de pulmão lisado em placas de ágar de isolamento de Pseudomonas em 10 vezes diluições em série.
7. Incubar as placas a 37 ° C por 24 h e contagem das colônias bacterianas para determinar o CFU por todo pulmão.

6. análise estatística

1. Usar o Student t-teste para determinar a significância estatística da diferença entre os dois grupos. Considere uma diferença estatisticamente significante quando p < 0,05. Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM).

Resultados

Primeiro realizamos o experimento para analisar a fagocitose por mouse AMs primários. Ao longo de todas as análises, comparamos AMs isolados de ratos de^KO WT e TRIM72. Como mostrado na Figura 1A, microscopia de fluorescência revelou que fagocitose dos grânulos de vidro-FITC pelo mouse AMs primárias ocorre após 1 h de incubação. Figura 1 B mostra a análise da fagocitose por cit...

Discussão

Durante a execução de uma função de troca de gás, o pulmão persistentemente confronta alérgenos, patógenos e partículas estranhas. AMs fornecem a primeira linha de defesa em virtude da sua função principal, ou seja a fagocitose. AMs também coordenam com outras células do sistema imunológico em destruir os patógenos e na resolução da inflamação. Aqui, descrevemos os métodos para avaliar especificamente a fagocitose por AMs isolada do pulmão do rato. O protocolo apresentado neste manuscrito explica um ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-G Needle	Nipro Medical	CI+1832-2C	Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molecular Biology grade
70% Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytical grade
96-well plate	Corning	3603	Cell Biology grade
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492	Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	Molecular Biology grade
C5 deficient serum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemical reagent
Centrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Forceps	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads	Sigma-Aldrich	L4530	Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Cell Biology grade
High-Pressure Syringe	Penn-Century	FMJ-250	Suitable for laboratory animal use
Homogenizer	Omni International	TH-01
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX73
Ketamine Hydrochloride	Hospira	CA-2904	Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	Cell Biology grade
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Molecular Biology grade
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagent grade
PBS	Gibco	20012-027	Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Suitable for immuno-assays
Scissors	Miltex	5-2	Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	LS-2	Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	Analytical grade
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small)	Fine Science Tools	91500-09	Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)	MP Biomedicals	55876	Washed, preserved SRBCs
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Molecular Biology grade
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	Pharmaceutical grade