Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لإنشاء ICR المناعة (معهد أبحاث السرطان) نموذج مورين من عدوى الجهاز العصبي المركزي لعرض تطور الاعتلال العصبي. ويمكن رصد اضطرابات الدماغ الفيروسية الحادة من خلال درجات المرض المتطابقة لإظهار الاعتلال العصبي الناجم عن فيروس حمى الضنك في الجسم الحي.

Abstract

فيروس حمى الضنك (DENV)، وهو فيروس ينتقل عن طريق المفصل ينتقل عن طريق البعوض، قد يسبب المرض الحاد المعروف باسم حمى الضنك النزفية، والذي يتميز بمضاعفات مميتة بسبب تسرب البلازما، الاستسقاء، الانصباب الجنبي، الضائقة التنفسية، نزيف حاد، وضعف الأعضاء. وهناك عدد قليل من حالات العدوى DENV تقديم مظاهر عصبية. ومع ذلك، لم تستكشف الدراسات الأمراض العصبية الناجمة عن DENV أكثر من ذلك. في هذه الدراسة، نقدم بروتوكوللاستخدام فأر ICR (معهد أبحاث السرطان) مناعية مناعية للتحقق من تحريض عدوى الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع DENV، يليه تطور التهاب الدماغ الفيروسي الحاد مثل التهاب الدماغ الفيروسي المرض.

Introduction

DENV، وهو فيروس يحمله المفصليمن عائلة Flaviviridae، يحتوي على جينوم RNA بالمعنى الإيجابي الذي يشفر ثلاثة بروتينات هيكلية فيروسية (كابسيد، قبل الغشاء، والمغلف) وسبعة بروتينات فيروسية غير هيكلية (NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B ، وNS5). الأنواع المصلية الأربعة من DENV (DENV1-4)، التي تصيب ما يقرب من 390 مليون شخص سنويا، تسبب عبئا عالميا على الرغم من أن الحكومات قد وجهت جهودا كبيرة نحو ناقلات البعوض ومكافحة الأمراض1. وفي الوقت الراهن، يجري تطوير لقاحات واقية وأدوية علاجية مضادة للفيروسات وتتطلب مزيدا من التحقق على المدى الطويل2. في الممارسة السريرية، على الرغم من أن مريض حمى الضنك مع عدوى الجهاز العصبي الوطني نادرة، فإنه يحتاج إلى مزيد من الاستكشاف لفهم تنوع تطور مرض حمى الضنك3. وثمة حاجة إلى مزيد من التحقيق والتحقق؛ وعلى وجه الخصوص، أدرجت منظمة الصحة العالمية مشاركة ضعف الجهاز العصبي الوطني، مثل ضعف الإدراك، والتشنجات، واعتلال الدماغ، والتهاب الدماغ، في تصنيف حمى الضنك الشديدة3و4. بناء نماذج حيوانية من عدوى DENV أمر لا غنى عنه لاستكشاف الأمراض العصبية من عدوى DENV.

لتوليد عدوى الجهاز العصبي المركزي من قبل DENV، وقد نفذت العديد من الدراسات طرق مختلفة من عدوى DENV، بما في ذلك (1) التلقيح داخل الدماغ من الفئران C57BL/6 الذين تلقوا 4 × 103 وحدات تشكيل البلاك (PFU) من DENV3 غير مكيفة5، 6، (2) التلقيح داخل التعامق من الفئران BALB / ج الذين تلقوا 7 × 104 PFU من في المختبر NEUROadaptED DENV47، (3) التلقيح داخل المخ من الفئران السويسرية الذين تلقوا 1 × 105 PFU من في الجسم الحي NEUROadapted DENV18، و (4) التلقيح المشترك داخل الدماغ وداخل اقفارية من الفئران الإمتصاص ICR الذين تلقوا 1 × 106 PFU من DENV2 غير مكيفة9. وفقا لنتائج هذه الدراسات5,6,7,8,9, عدوى DENV في الفئران تؤدي إلى النسخ الفيروسي في الدماغ , مما يؤدي إلى الفيروسية الحادة متلازمات التهاب الدماغ مثل، والتغيرات السلوكية مصحوبة بشلل الأطراف وعدم الاستقرار الوضعي، والسمية العصبية للسي إن سي والتهاب، وتسرب البلازما العامة والمحلية من خلال حاجز الدم في الدماغ (BBB)، والفتك. وقد أظهرت جميع النتائج من هذه الدراسات5،6،7،8،9 قدرة DENV لإصابة الجهاز العصبي المركزى وتحريض التهاب الدماغ الفيروسي الحاد مثل المرض بعد العدوى.

بناء على النتائج الحاليةلدينا9،10،11،12،13،14،15،أنشأنا نموذج مورين من عدوى DENV باعتبارها في الجسم الحي منصة لدراسة الفعالية العلاجية للعوامل المستهدفة / العوامل ضد النسخ المتماثل الفيروسي، فضلا عن السمية العصبية. هنا، نبلغ عن البروتوكول المستخدم لإنشاء فأرICR خارجي مناعية للمناعة لدراسة عدوى الجهاز العصبي الوطني ولرصد تطور الاعتلال العصبي مع شدة مختلفة الناجمة عن DENV. وتظهر النتائج التقدم الكبير للأمراض الشبيهة بالتهاب الدماغ في الفئران المصابة بDENV بطريقة تعتمد على الوقت.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية لدراسة الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات والمستخدم في المركز الطبي للدفاع الوطني (IACUC رقم: 16-261)، وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان.

1. إجراء العدوى

  1. إعداد DENV2 غير مكيفة (سلالة PL046) الأسهم9 (التي تم الحصول عليها أصلا من مراكز مكافحة الأمراض في تايوان، تتراوح بين 2.5 × 107 إلى 1 × 109 PFU / مل).
  2. تخفيف مخزون الفيروس إلى 1 × 106 PFU مع معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة إلى حجم إجمالي قدره 40 درجة مئوية.
  3. ملء حقنة واحدة 0.3 مل مزودة إبرة 30 G مع 10 ميكرولتر (2.5 × 105 PFU) من الفيروس المخفف، وملء آخر 0.3 مل حقنة مزودة إبرة 30 G مع 30 ميكرولتر (7.5 × 105 PFU) من الفيروس المخفف.
  4. اضغط على ماوس الإصصاصال ICR البالغ من العمر 7 أيام وقم بإجراء الخطوات التالية.
    1. للحقن داخل المخ، عقد الماوس في موقف عرضة عن طريق الضغط على الأوريكل بين السبابة والإبهام، وحقن داخل الدماغ 10 ميكرولتر من الفيروس المخفف في منطقة لامدا، النقطة عند تقاطع خياطة sagittal وlambdoid 16.
    2. بعد الحقن داخل الدماغ، عقد الماوس في موقف supine باستخدام السبابة والإبهام وحقن داخل peritoneally 30 درجة مئوية من الفيروس المخفف بلطف في البطن المورين.
      ملاحظة: لتجنب أكل لحوم البشر، يتم استخدام الكحول بنسبة 75٪ لخلق فقدان مؤقت للإحساس الشمي للأم. بالإضافة إلى ذلك، يتم اقتراح تغطية القمامة مع البراز والبول الأم.
  5. وضع الفئران الإمتصاص مرة أخرى في أقفاصهم والانتظار لمدة 5 دقائق للتحقق من السلامة poststimulation مع متعطشا من الفئران، بما في ذلك المشي والأم مص الحليب.
    ملاحظة: في معظم الأحيان، تظهر الفئران النشاط الطبيعي poststimulation ولا يبدو أن هناك أي آثار ضارة بعد التحدي التقني. وخلال هذه التجربة، تمت صيانة الحيوانات من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية والمستخدم في المركز الطبي للدفاع الوطني، تايوان.
  6. تقييم التقدم اليومي للفئران من حيث وزن الجسم (باستخدام توازن ميكروغرام)، والأمراض الحادة الشبيهة بالتهاب الدماغ الفيروسي (حسب تسجيل المرض كما هو موضح في القسم 2)، ومعدل البقاء على قيد الحياة9و10و11 ،12،13،14،15.

2. تسجيل الأمراض

  1. مراقبة درجة الأمراض الحادة الشبيهة بالتهاب الدماغ الفيروسي. تعيين درجة 0 إلى الفئران صحية; 1 إلى الفئران مع أعراض المرض طفيفة, بما في ذلك فقدان الوزن, انخفاض الحركة, والتوجه الجسم حدبة; 2 إلى الفئران التي تظهر النوبات الحوفية. 3 إلى الفئران تظهر ضعف الحفي، بما في ذلك التحرك بصعوبة وضعف الطرف الأمامي أو الطرف الخلفي؛ 4 للشلل; خمسة للموت
    ملاحظة: وبمجرد أن تصل النتيجة إلى 3، تعتبر أعراض المرض تتطور بسرعة.
  2. رسم التهديف من المرض، وفقا للخطوة 2.1، لكل يوم كشخصية على أساس منحنى باستخدام متوسط ± SD من درجات الاختبار اليومي في كل مجموعة.

النتائج

تم الإبلاغ عن مضاعفات عصبية شديدة مرتبطة بحمى الضنك في المرضى الذين يعانون من مرض حمى الضنك4. على الرغم من أن هذه الحالات نادرة في العيادة، يمكن استخدام إنشاء نموذج المورين المناعي من عدوى DENV ليس فقط لدراسة مسببات الأمراض المناعية ولكن أيضا لاستكشاف عدوى الج...

Discussion

تم الكشف عن عدوى DENV في الجهاز العصبي الوطني لمرضى حمى الضنك الشديدة3،17، مما يشير إلى إمكانية ظهور التهاب الدماغ الفيروسي الحاد وقعت خلال مرض حمى الضنك. هنا، نبلغ عن نموذج في الجسم الحي من عدوى DENV لدراسة مشاركة خلل الجهاز العصبي المركزي في حمى الضنك الشديدة، ...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذه الدراسة بمنح من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST107-2321-B-038-001) والتمويل الداخلي 106TMU-CIT-01-2، تايبيه، تايوان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)Gibco11875-085Diluting virus
0.3-mL Insulin Syringe BD Ultra-Fine­II328838Intracerebral and intraperitoneal injection
MicrobalanceMETTLER TOLEDO's LabXAL104Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)The Centers for Disease Control of Taiwan-Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouseBioLASCO Taiwan Co., Ltd-Our murine model

References

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. . Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910 (2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715 (2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91 (2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146Murine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved