뎅기열 바이러스 유발 급성 바이러스 뇌염 같은 질병의 뮤린 모델

요약

여기에서, 우리는 신경병의 발달을 표시하기 위하여 중추 신경계 감염의 면역적격 ICR (암 연구 연구소) 뮤린 모형을 만들기위한 프로토콜을 제시합니다. 동일한 질병 점수에 의한 급성 바이러스 성 뇌질환 모니터링은 생체 내에서 뎅기열 바이러스 유발 신경병증을 나타내는 데 수행될 수 있었다.

초록

뎅기열 바이러스 (DENV), 모기에 의해 전달 되는 절지 동물 매개 바이러스, 뎅기열 출혈열로 알려진 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다., 플라즈마 누출으로 인해 치명적인 합병증을 특징으로 하는, 복수, 흉막 삼출액, 호흡 곤란, 심한 출혈, 장기 장애. DENV 감염의 몇 가지 경우는 신경 학적 증상을 제시; 그러나, 연구는 DENV 유도된 신경 병증을 더 탐구하지 않았습니다. 본 연구에서, 우리는 DENV를 가진 중추 신경계 (CNS) 감염의 유도를 조사하기 위한 면역 적격 outbred ICR (암 연구 연구소) 마우스를 사용하는 프로토콜을 제시하고, 급성 바이러스성 뇌염의 진행에 선행됩니다 질병.

서문

FLAviviridae 가족의 절지 동물 매개 바이러스 인 DENV는 3 개의 바이러스 구조 단백질 (캡시드, 전막 및 봉투)과 7 개의 바이러스 성 비 구조적 단백질 (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B)을 암호화하는 양성 감각 RNA 게놈을 포함합니다. 및 NS5)를 참조하십시오. 매년 약 3억 9천만 명을 감염시키는 DENV(DENV1-4)의 4가지 혈청형은 정부가 모기 벡터 및질병 대조군 1을 향한 상당한 노력을 기울였음에도 불구하고 전 세계적인 부담을 야기한다. 현재, 보호 백신 및 치료 항 바이러스 약물은 개발중이며 추가적인 장기 검증이 필요합니다 2. 임상 사례에서, CNS 감염을 가진 뎅기열 환자는 드물더라도, 뎅기열 질병 발달의 다양성을 이해하기 위하여 더 탐구될 필요가^있다3. 추가 조사 및 유효성 검사가 필요합니다. 특히, 세계보건기구(WHO)는 중증 뎅기열 3,^4의분류에 인지 장애, 경련, 뇌병증 및 뇌염과 같은 CNS 장애의 참여를 포함하였다. DENV 감염의 동물 모델을 구축하는 것은 DENV 감염의 신경 병증을 탐구하는 데 필수적입니다.

DENV에 의한 CNS 감염을 생성하기 위해, 여러 연구는 (1) 적응되지 않은 DENV3 5의 4 x 10³ 플라크 형성 단위 (PFU)를 받은 C57BL/6 마우스의 내역 성 접종을 포함하여 DENV 감염의 다른 경로를 실행했습니다. ^6,(2) 생체외 신경적응 DENV4^7,(3) 생체 내 신경 적응 DENV1 8의 1 x 10⁵ PFU를 받은 스위스 마우스의 자궁 내 내 접종을 받은 BALB/c마우스의 복강 내 접종 적응되지 않은 DENV2^9의1 x 10⁶ PFU를 받은 ICR 빨기 마우스의 인내뇌및 복강 내 공동 접종. 이러한 연구의 결과에 따르면^5,6,^7,8,9,DENV 감염은 뇌에서 바이러스 복제를 초래하여 급성 바이러스성으로 이어진다. 뇌염과 같은 증후군, 사지 마비와 자세 불안정을 동반 행동 변화, CNS 신경 독성 및 염증, 혈액 - 뇌 장벽을 통해 일반 및 국소 혈장 누출 (BBB), 및 치사. 이러한 연구의 모든결과 5,^6,7,8, 9는 DENV가 CNS를 감염시키고 급성 바이러스성 뇌염과 같은 유도를 하는 능력을 보여주었다. 감염 다음 질병.

우리의 현재 사실인정에 근거하여 9,^{10,11,12,13,14,15,}우리는 생체 내로 DENV 감염의 뮤린 모형을 만들었습니다 바이러스 복제에 대한 표적 제제 / 요인의 치료 효능뿐만 아니라 신경 독성을 검사하는 플랫폼. 여기에서, 우리는 CNS 감염을 공부하고 DENV에 기인한 다른 경벌을 가진 신경병의 발달을 감시하기 위하여 면역적격 outbred ICR 마우스를 만들기 위하여 이용된 프로토콜을 보고합니다. 결과는 DENV 감염마우스에서 뇌염과 같은 질병의 유의한 진행을 시간 의존적인 방식으로 보여준다.

프로토콜

동물 연구의 실험 프로토콜은 대만 과학기술부에 의해 수립 된 지침에 따라 국방 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용자위원회 (IACUC 번호 : 16-261)에 의해 승인되었습니다.

1. 감염 절차

1. 적응되지 않은 DENV2 (변형 PL046) 주식⁹ (원래 대만 질병 통제 센터에서 얻은, 2.5 x 10⁷ 에서 1 x 10⁹ PFU / mL).
2. 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지를 사용하여 바이러스 스톡을 1 x 10⁶ PFU로 총 부피 40 μL로 희석합니다.
3. 희석 된 바이러스의 10 μL (2.5 x 10⁵ PFU)와 30G 바늘이 장착 된 0.3 mL 주사기 하나를 채우고 희석 된 바이러스의 30 μL (7.5 x 10⁵ PFU)로 30G 바늘이 장착 된 다른 0.3 mL 주사기를 채웁니다.
4. 7일된 ICR 을 잡고 다음 단계를 수행합니다.
   1. 내뇌 주사의 경우, 집게 손가락과 엄지 손가락 사이의 주경을 눌러 경향이 있는 위치에 마우스를 잡고, 회골과 람도이드 봉합사의 교차점에 있는 람다 부위에 희석된 바이러스 10 μL을 무혐의로 주입합니다. ¹⁶.
   2. 내뇌 주사 후, 검지 손가락과 엄지손가락을 사용하여 마우스를 척추 위치에 잡고 복강 내 30 μL의 희석 바이러스를 무린 abdomenl에 부드럽게 주입합니다.
      참고 : 식인 풍습을 피하기 위해 75 %의 알코올은 어머니의 후각 감각을 일시적으로 상실하는 데 사용됩니다. 또한, 그들의 어머니의 발판 및 소변으로 쓰레기를 덮는 것이 건의됩니다.
5. 새장에 다시 빨기 마우스를 놓고 5 분 동안 기다린 후 걷기와 모유 빨기를 포함하여 쥐의 열렬함으로 안전 포스트 자극을 확인합니다.
   참고: 대부분의 경우, 마우스는 정상적인 활동 게시물을 보여자극하고 기술적 인 도전 다음 유해한 효과가없는 것 같다. 이 실험 동안, 동물은 대만 국방 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용자 위원회에 의해 유지되었다.
6. 체중(마이크로그램 밸런스를 사용하여), 급성 바이러스성 뇌염 유사 질환(섹션 2에 설명된 대로 질병 점수 매기기), 생존율^{9,10,11의 관점에서 마우스의 일일 진행 상황을 평가합니다. ,12,13,14,15}.

2. 질병 점수 매기기

1. 급성 바이러스 성 뇌염과 같은 질병의 등급을 모니터링합니다. 건강한 마우스에 0의 점수를 할당; 1 경미한 질병 증상을 가진 마우스, 체중 감소를 포함 하 여, 감소 이동성, 그리고 hunchback 신체 방향; 2는 변연계 발작을 나타내는 마우스; 3 마우스에 난이도 및 전방 사지 또는 후방 사지 약점을 가진 이동을 포함하는 변연계 약점을 나타낸다; 마비에 대 한 4; 5 죽음.
   참고: 점수가 3에 도달하면 질병 증상은 빠르게 진화하는 것으로 간주됩니다.
2. 2.1단계에 따라, 각 군의 일일 시험 점수의 평균 ±SD를 이용하여 곡선 기반 도면으로서 매일 질병의 스코어링을 플로팅한다.

결과

가혹한 뎅기열 관련 신경학상 합병증은 뎅기열 병인을 위한 환자에서 보고되었습니다^4. 이러한 경우는 클리닉에서 드물지만 DENV 감염의 면역 적격 뮤린 모델을 만드는 것은 면역 요법 생성을 연구하는 데 뿐만 아니라 CNS 감염, 신경 염증, 신경 독성 및 급성 바이러스를 탐구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 뇌염과 같은 질병. 본 연구에서, 우리의 현재

토론

DENV 감염은 중증 뎅기열 환자^3,17의CNS에서 검출되었으며, 뎅기열 병인 동안 급성 바이러스 성 뇌염의 발현 가능성을 시사한다. 여기에서, 우리는 가혹한 뎅기열에 있는 CNS 역기능의 관련을 공부를 위한 DENV 감염의 생체 내 murine 모형을 보고합니다, 특히 DENV 유도한 심각한 바이러스성 뇌염 같이 질병에 초점으로. 이전 모델과 비교하여, 특히 단일 경로 감?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)	Gibco	11875-085	Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe	BD Ultra-Fine­II	328838	Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance	METTLER TOLEDO's LabX	AL104	Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)	The Centers for Disease Control of Taiwan	-	Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse	BioLASCO Taiwan Co., Ltd	-	Our murine model