Un modèle murine de la dengue virus induite par l'encéphalite virale aigue comme la maladie

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour créer un modèle murine immunocompétent d'IC (Institut de recherche sur le cancer) de l'infection de système nerveux central pour montrer le développement de la neuropathie. La surveillance des désordres encéphalitiques virales aigues par des scores identiques de maladie pourrait être exécutée pour montrer la neuropathie virus-induite de dengue in vivo.

Résumé

Le virus de la dengue (DENV), un virus transmis par les arthropodes transmis par les moustiques, peut causer la maladie grave connue sous le nom de dengue hémorragique, qui se caractérise par des complications mortelles dues à des fuites de plasma, ascites, effusion pleurale, détresse respiratoire, saignements graves et une déficience des organes. Quelques cas d'infection de DENV présentent des manifestations neurologiques ; cependant, les études n'ont pas exploré la neuropathogenèse DENV-induite plus loin. Dans cette étude, nous présentons un protocole pour employer une souris d'IC (Institut de recherche sur le cancer) de surcapacité immunocompétente pour étudier l'induction de l'infection de système nerveux central (CNS) avec DENV, suivie de la progression de l'encéphalite virale aigue-comme maladie.

Introduction

DENV, un virus transmis par les arthropodes de la famille des Flaviviridae, contient un génome d'ARN à sens positif qui code trois protéines structurelles virales (capsid, prémembrane et enveloppe) et sept protéines virales non structurelles (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , et NS5). Les quatre sérotypes de DENV (DENV1-4), qui infectent environ 390 millions de personnes par an, causent un fardeau mondial, même si les gouvernements ont orienté des efforts substantiels vers les moustiques vecteurs et la lutte contre les maladies¹. À l'heure actuelle, des vaccins protecteurs et des médicaments antiviraux thérapeutiques sont en cours de développement et nécessitent une validation à long terme². En pratique clinique, bien qu'un patient de dengue avec l'infection de CNSsoit rare, il doit être davantage exploré pour comprendre la diversité du développement de la dengue 3. Une enquête et une validation plus poussées sont nécessaires; notamment, l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) a inclus la participation de l'affaiblissement du SNC, tels que les troubles cognitifs, les convulsions, l'encéphalopathie et l'encéphalite, dans la classification de la dengue sévère^3,4. La construction de modèles animaux d'infection par le DENV est indispensable pour explorer la neuropathogenèse de l'infection à DENV.

Pour générer l'infection par DENV de CNS, plusieurs études ont exécuté différents itinéraires de l'infection de DENV, y compris (1) l'inoculation intracérébrale des souris de C57BL/6 qui ont reçu 4 x 10³ unités de plaque-formation (PFU) de DENV3^nonadapté^{, 6}, (2) inoculation intrapéritonéale des souris BALB/c qui ont reçu 7 x 10⁴ PFU de DENV4 neuroadapté in vitro⁷, (3) inoculation intracérébrale de souris suisses qui ont reçu 1 x 10⁵ PFU de vivo neuroadapté DENV1⁸, et (4) co-inoculation intracérébrale et intrapéritonéale des souris allaitantes iCR qui ont reçu 1 x 10⁶ PFU de DENV2 non adapté⁹. Selon les résultats de ces études^5,6,7,8,9, infection DENV chez les souris entraîner une réplication virale dans le cerveau, conduisant à des Syndromes d'encéphalite-comme, changements comportementaux accompagnés de la paralysie de membre et de l'instabilité posturale, neurotoxicité et inflammation de CNS, fuite générale et localisée de plasma par la barrière hémato-encéphalique (BBB), et létalité. Tous les résultats de ces études^5,6,7,8,9 ont montré la capacité du DENV à infecter le SNC et l'induction d'une encéphalite virale aigue maladie à la suite d'une infection.

Sur la base de nos résultats actuels^{9,10,11,12,13,14,15}, nous avons créé un modèle murine de l'infection DENV comme un in vivo plate-forme pour examiner l'efficacité thérapeutique des agents/facteurs ciblés contre la réplication virale, aussi bien que la neurotoxicité. Ici, nous rapportons le protocole utilisé pour créer une souris iCR hors-sang immunocompétente pour étudier l'infection de CNS et pour surveiller le développement des neuropathies avec différentes severities provoquées par DENV. Les résultats montrent la progression significative de la maladie encéphalite-comme chez les souris deDENV-infectées d'une manière dépendante du temps.

Protocole

Les protocoles expérimentaux d'étude animale ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation du National Defense Medical Center (numéro 16-261 de l'IACUC), selon les lignes directrices établies par le Ministère des sciences et de la technologie de Taïwan.

1. Procédure d'infection

1. Préparer les stocks non adaptés de DENV2 (souche PL046)⁹ (obtenus à l'origine auprès des Centers for Disease Control de Taiwan, allant de 2,5 x 10⁷ à 1 x 10⁹ PFU/mL).
2. Diluer le stock de virus à 1 x 10⁶ PFU avec Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen à un volume total de 40 L.
3. Remplissez une seringue de 0,3 ml ml munie d'une aiguille de 30 G avec 10 l (2,5 x 10⁵ PFU) de virus dilué et remplissez une autre seringue de 0,3 ml ml munie d'une aiguille de 30 G avec 30 l (7,5 x 10⁵ PFU) de virus dilué.
4. Tenez la souris de titrage ICR de 7 jours et effectuez les étapes suivantes.
   1. Pour l'injection intracérébrale, maintenez la souris dans une position encline en appuyant sur l'auriculaire entre l'index et le pouce, et injectez intracérébralement 10 l de virus dilué dans la zone lambda, le point à l'intersection de la suture sagittale et lambdoid ¹⁶.
   2. Après l'injection intracérébrale, maintenez la souris en position de supine en utilisant l'index et le pouce et injectez par voie intrapéritone 30 l de virus dilué doucement dans l'abdomen murine.
      REMARQUE : Pour éviter le cannibalisme, 75 % de l'alcool est utilisé pour créer une perte temporaire de la sensation olfactive de la mère. En outre, il est suggéré de recouvrir les portées avec les selles et l'urine de leur mère.
5. Posez les souris allaitantes dans leurs cages et attendez 5 min pour vérifier leur poststimulation de sécurité avec l'avidité des souris, y compris la marche et la succion du lait maternel.
   REMARQUE: Le plus souvent, les souris démontrent une poststimulation d'activité normale et il ne semble pas y avoir d'effets nocifs après le défi technique. Au cours de cette expérience, les animaux ont été maintenus par le Comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisateurs du National Defense Medical Center, Taiwan.
6. Évaluer les progrès quotidiens des souris en termes de poids corporel (en utilisant un bilan microgramme), d'encéphalite virale aigue (par la notation de la maladie telle que décrite dans la section 2), et le taux de survie^{9,10,11 ,12,13,14,15}.

2. Notation de la maladie

1. Surveillez le grade des maladies virales aigues semblables à l'encéphalite. Attribuez un score de 0 à des souris en bonne santé; 1 pour les souris présentant des symptômes de maladie mineure, y compris la perte de poids, la mobilité réduite, et une orientation de corps de bossu ; 2 aux souris qui présentent une crise limbique; 3 aux souris la faiblesse limbique d'exposition, y compris se déplaçant avec la difficulté et la faiblesse antérieure de membre ou postérieure ; 4 pour paralysie; 5 pour la mort.
   REMARQUE: Une fois que le score atteint 3, les symptômes de la maladie sont considérés comme évoluant rapidement.
2. Tracer la notation de la maladie, selon l'étape 2.1, pour chaque jour comme une figure basée sur la courbe en utilisant la moyenne - SD des scores de test quotidiens dans chaque groupe.

Résultats

Des complications neurologiques graves associées à la dengue ont été signalées chez des patients atteints de pathogénie de la dengue⁴. Bien que ces cas soient rares dans la clinique, la création d'un modèle murine immunocompétent de l'infection de DENV peut être employée non seulement pour étudier l'immunopathogenèse mais également pour explorer l'infection de CNS, la neuroinflammation, la neurotoxicité, et le viral aigu maladie ressemblant à une ma...

Discussion

L'infection de DENV a été détectée dansle CNS des patients graves de dengue 3,^17,suggérant la possibilité de la manifestation de l'encéphalite virale aigue s'est produite pendant la pathogénie de dengue. Ici, nous rapportons un modèle murine in vivo de l'infection de DENV pour étudier la participation du dysfonctionnement de CNS dans la dengue grave, particulièrement avec un foyer sur DENV-induite maladies virales-comme. Par rapport aux modèles préc?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)	Gibco	11875-085	Diluting virus
0.3-mL Insulin Syringe	BD Ultra-Fine­II	328838	Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance	METTLER TOLEDO's LabX	AL104	Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)	The Centers for Disease Control of Taiwan	-	Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse	BioLASCO Taiwan Co., Ltd	-	Our murine model