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  • Resumen
  • Introducción
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para crear un modelo murino irevolucionario inmunocompetente (Instituto de Investigación del Cáncer) de infección del sistema nervioso central para mostrar el desarrollo de la neuropatía. El control de trastornos encefalíticos víricos agudos por puntuaciones idénticas de enfermedad podría realizarse para mostrar in vivo la neuropatía inducida por el virus del dengue.

Resumen

El virus del dengue (DENV), un virus transmitido por artrópodos transmitido por mosquitos, puede causar la enfermedad grave conocida como fiebre hemorrágica por dengue, que se caracteriza por complicaciones letales debido a fugas plasmáticas, ascitis, derrame pleural, dificultad respiratoria, sangrado grave y deterioro de los órganos. Algunos casos de infección por DENV presentan manifestaciones neurológicas; sin embargo, los estudios no han explorado más la neuropatógenosis inducida por DENV. En este estudio, presentamos un protocolo para utilizar un ratón ICR (Instituto de Investigación del Cáncer) inmunocompetente para investigar la inducción de la infección del sistema nervioso central (SNC) con DENV, seguido de la progresión de la encefalitis vírica aguda Enfermedad.

Introducción

DENV, un virus transmitido por artrópodos de la familia Flaviviridae, contiene un genoma de ARN de sentido positivo que codifica tres proteínas estructurales virales (cápside, premembrana y envolvente) y siete proteínas no estructurales virales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , y NS5). Los cuatro serotipos del DENV (DENV1-4), que infectan a aproximadamente 390 millones de personas al año, causan una carga mundial a pesar de que los gobiernos han dirigido esfuerzos sustanciales hacia el control de vectores de mosquitos y enfermedades1. Actualmente, las vacunas protectoras y los antivirales terapéuticos están en desarrollo y requieren una mayor validación a largo plazo2. En la práctica clínica, aunque un paciente con dengue con infección por el SNC es poco frecuente, es necesario explorarlo más a fondo para comprender la diversidad del desarrollo de la enfermedad del dengue3. Se necesitan más investigaciones y validación; en particular, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha incluido la participación del deterioro del SNC, como deterioro cognitivo, convulsiones, encefalopatía y encefalitis, en la clasificación del dengue grave3,4. La construcción de modelos animales de infección por DENV es indispensable para explorar la neuropatógenosis de la infección por DENV.

Para generar la infección por El SNC por DENV, varios estudios han ejecutado diferentes vías de infección por DENV, incluyendo (1) inoculación intracerebral de ratones C57BL/6 que recibieron 4 x 103 unidades formadoras de placas (PFU) de DENV35noadaptados, 6, (2) inoculación intraperitoneal de ratones BALB/c que recibieron 7 x 104 PFU de DENV47,(3) inoculación intracerebral de ratones suizos que recibieron 1 x 105 PFU de IN vivo neuroadaptado DENV18y (4) co-inoculación intracerebral e intraperitoneal de ratones chupadores ICR que recibieron 1 x 106 PFU de DENV29no adaptados. Según los resultados de estos estudios5,6,7,8,9, la infección POR DENV en ratones resulta en replicación viral en el cerebro, dando lugar a síndromes similares a la encefalitis, cambios de comportamiento acompañados de parálisis de las extremidades e inestabilidad postural, neurotoxicidad e inflamación del SNC, fuga de plasma general y localizado a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y letalidad. Todos los resultados de estos estudios5,6,7,8,9 han demostrado la capacidad de DENV para infectar el SNC y la inducción de la encefalitis vírica aguda enfermedad tras la infección.

Sobre la base de nuestros hallazgos actuales9,10,11,12,13,14,15, hemos creado un modelo murino de infección DENV como un in vivo para examinar la eficacia terapéutica de los agentes/factores dirigidos contra la replicación viral, así como la neurotoxicidad. Aquí, informamos del protocolo utilizado para crear un ratón ICR de raza superior inmunocompetente para estudiar la infección por el SNC y para monitorear el desarrollo de neuropatías con diferentes gravedades causadas por DENV. Los resultados muestran la progresión significativa de la enfermedad similar a la encefalitis en ratones infectados por el DENV de una manera dependiente del tiempo.

Protocolo

Los protocolos experimentales de estudio en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y Usuarios del Centro Médico de Defensa Nacional (número IACUC: 16-261), de acuerdo con las directrices establecidas por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán.

1. Procedimiento de infección

  1. Preparar las existencias no adaptadas de DENV2 (strain PL046)9 (obtenido originalmente de los Centros para el Control de Enfermedades en Taiwán, que van desde 2.5 x 107 a 1 x 109 PFU/mL).
  2. Diluir el stock de virus a 1 x 106 PFU con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio a un volumen total de 40 L.
  3. Llene una jeringa de 0,3 ml equipada con una aguja de 30 G con 10 ml (2,5 x 105 PFU) de virus diluido y llene otra jeringa de 0,3 ml equipada con una aguja de 30 G con 30 ml (7,5 x 105 PFU) de virus diluido.
  4. Sostenga el ratón de la madreito ICR de 7 días de edad y realice los siguientes pasos.
    1. Para la inyección intracerebral, sostenga el ratón en una posición propensa presionando la aurícula entre el dedo índice y el pulgar, e inyecte por vía intracerebral 10 l de virus diluido en el área lambda, el punto en la intersección de la sutura sagital y lambdoid 16.
    2. Después de la inyección intracerebral, sostenga el ratón en posición supina utilizando el dedo índice y el pulgar e inyecte por vía intraperitoneal 30 l de virus diluido suavemente en el abdomen murino.
      NOTA: Para evitar el canibalismo, 75% de alcohol se utiliza para crear una pérdida temporal de la sensación olfativa de la madre. Además, se sugiere cubrir las camadas con las heces y la orina de su madre.
  5. Poner los ratones lactantes de nuevo en sus jaulas y esperar 5 minutos para comprobar su seguridad postestimulación con la avidez de ratones, incluyendo caminar y chupar leche madre.
    NOTA: Muy a menudo, los ratones demuestran actividad normal después de la estimulación y no parece haber efectos nocivos después del desafío técnico. Durante este experimento, los animales fueron mantenidos por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y Usuarios del Centro Médico de Defensa Nacional, Taiwán.
  6. Evaluar el progreso diario de los ratones en términos de peso corporal (mediante el uso de un equilibrio de microgramos), enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda (por puntuación de la enfermedad como se describe en la sección 2), y tasa de supervivencia9,10,11 ,12,13,14,15.

2. Puntuación de enfermedades

  1. Controlar el grado de enfermedades similares a la encefalitis viral aguda. Asigne una puntuación de 0 a ratones sanos; 1 a ratones con síntomas de enfermedad menores, incluyendo pérdida de peso, movilidad reducida y una orientación corporal jorobado; 2 a ratones que presentan convulsiones límbicas; 3 a ratones la exhibición de debilidad límbica, incluyendo moverse con dificultad y la debilidad de la extremidad anterior o posterior; 4 para la parálisis; 5 por la muerte.
    NOTA: Una vez que la puntuación alcanza 3, se considera que los síntomas de la enfermedad evolucionan rápidamente.
  2. Trazar la puntuación de la enfermedad, de acuerdo con el paso 2.1, para cada día como una figura basada en curvas utilizando la media de SD de las puntuaciones diarias de las pruebas en cada grupo.

Resultados

Se han notificado complicaciones neurológicas graves asociadasal dengue en pacientes por dengue patógeno 4. Aunque estos casos son raros en la clínica, la creación de un modelo murino inmunocompetente de infección por DENV se puede utilizar no sólo para estudiar la inmunopatógeno, sino también para explorar la infección por el SNC, neuroinflamación, neurotoxicidad y viral agudo enfermedad similar a la encefalitis. En este estudio, según nuestro modelo ac...

Discusión

Se ha detectado una infección por DENV en el SNC de pacientes con dengue grave3,17, lo que sugiere la posibilidad de que la manifestación de encefalitis vírica aguda se haya producido durante la patogénesis del dengue. Aquí, informamos de un modelo in vivo murino de infección por DENV para estudiar la participación de la disfunción del SNC en el dengue grave, particularmente con un enfoque en enfermedades similares a la encefalitis vírica aguda inducidap...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST107-2321-B-038-001) y la financiación intramuros 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwán.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)Gibco11875-085Diluting virus
0.3-mL Insulin Syringe BD Ultra-Fine­II328838Intracerebral and intraperitoneal injection
MicrobalanceMETTLER TOLEDO's LabXAL104Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)The Centers for Disease Control of Taiwan-Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouseBioLASCO Taiwan Co., Ltd-Our murine model

Referencias

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