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要約

ここでは、神経障害の発症を示す中枢神経系感染の免疫能ICR(がん研究所)マウスモデルを作成するためのプロトコルを提示する。同一の疾患スコアによる急性ウイルス脳障害のモニタリングは、デング熱ウイルス誘発性神経障害を生体内で示すための行うことができる。

要約

蚊によって伝染する節足動物媒介ウイルスであるデング熱ウイルス(DENV)は、血漿漏出、腹水、胸水、呼吸困難による致死的合併症を特徴とするデング出血熱として知られる重篤な疾患を引き起こす可能性がある。重度の出血、および臓器障害。DENV感染のいくつかのケースは、神経学的症状を提示;しかし、研究はDENV誘発神経病因をさらに探索していない。本研究では、DENVによる中枢神経系(CNS)感染の誘導を調べ、その後急性ウイルス性脳炎様の進行を調べるための免疫能力のあるアウトブレッドICR(がん研究所)マウスを用いるプロトコルを提示する。病気。

概要

Flaviviridaeファミリーの節足動物媒介ウイルスであるDENVは、3つのウイルス構造タンパク質(カプシド、プレメンブレン、エンベロープ)と7つのウイルス非構造タンパク質(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B)をコードする陽性感のRNAゲノムを含んでいます。、および NS5)。年間約3億9,000万人に感染するDENV(DENV1-4)の4つの血清型は、政府が蚊のベクターと疾病対策1に向けた実質的な取り組みを行っているにもかかわらず、世界的な負担を引き起こす。現在、保護ワクチンおよび治療用抗ウイルス薬は開発中であり、さらに長期的な検証必要とする2.臨床現場では、CNS感染のデング熱患者はまれであるが、デング熱病発症の多様性を理解するためにさらに探索する必要がある3.さらなる調査と検証が必要です。特に、世界保健機関(WHO)は、重度のデング熱3、4の分類において、認知障害、痙攣、脳症、脳炎などのCNS障害の関与を含んでいる。DENV感染の神経因性発生を探索するためには、DENV感染の動物モデルの構築が不可欠である。

DENVによるCNS感染を生成するために、いくつかの研究は、(1)未適応DENV35の4 x 103プラーク形成ユニット(PFU)を受けたC57BL/6マウスの脳内接種を含む、DENV感染の異なる経路を実行した。6、(2)インビトロ神経適応DENV47の7 x 104 PFUを受けたBALB/cマウスの上食内接種、(3)インビボ神経適応DENV18の1 x 105 PFUを受けたスイスマウスの脳内接種、および(4)非適応DENV29の1 x 106 PFUを受けたICR吸引マウスの脳内および腹腔内共同接種。これらの研究の所見によれば、マウスにおけるDENV感染は脳内のウイルス複製をもたらし、急性ウイルスをもたらす脳炎様症候群、四肢麻痺および姿勢不安定を伴う行動変化、CNS神経毒性および炎症、血液脳関門(BBB)を介した一般的および局所的な血漿漏出、および致死性。これらの研究からのすべての結果5,6,7,8,9は、CNS に感染するDENVの能力と急性ウイルス性脳炎様の誘導を示しています感染後の病気。

我々の現在の知見に基づいて9 ,10,11,12,13,14,15,我々は、インビボとしてDENV感染のマウスモデルを作成しましたウイルス複製に対する標的剤/因子の治療有効性、ならびに神経毒性を調べるプラットフォーム。ここでは、CNS感染を研究し、DENVによって引き起こされる異なる切断性を有する神経障害の発症を監視するために、免疫能力の高いアウトブレッドICRマウスを作成するために利用されるプロトコルを報告する。この結果は、DENV感染マウスにおける脳炎様疾患の有意な進行を時間依存的に示した。

プロトコル

動物研究の実験的なプロトコルは、台湾の科学技術省が定めたガイドラインに従って、国防医療センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC番号:16-261)によって承認されました。

1. 感染手順

  1. 未適応のDENV2(株PL046)株9(もともと台湾の疾病管理センターから入手した、2.5 x 107から1 x 109 PFU/mLまで)を調記します。
  2. ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地でウイルスストックを1 x 106 PFUに希釈し、総容積を40μLにします。
  3. 希釈ウイルスの10 μL(2.5 x 105 PFU)で30G針を装着した0.3mLシリンジを1本充填し、希釈ウイルスの30 μL(7.5 x 105 PFU)で30G針を装着した別の0.3 mLシリンジを充填します。
  4. 7日前のICRを吸うマウスを保持し、次の手順を実行します。
    1. 脳内注射の場合は、人差し指と親指の間の口腔を押してマウスを起こしやすい位置に保持し、乳腺領域に10μLの希釈ウイルスを脳内に注入し、矢状縫合糸と子羊の縫合糸の交点を指差し止めする。16.
    2. 脳内注射の後、人差し指と親指を使用してマウスをスプリンの位置に保持し、30 μLの希釈ウイルスをマウスアブドムンに穏やかに注入する。
      注:カニバリズムを避けるために、75%のアルコールは、母親の嗅覚の一時的な損失を作成するために使用されます。また、母親の便と尿でゴミを覆うことをお勧めします。
  5. 子をケージに戻し、5分間待って、歩行や母乳吸引を含むマウスの熱心さで安全ポスト刺激を確認します。
    注:ほとんどの場合、マウスは正常な活動のポスト刺激を示し、技術的な課題に続く有害な影響はないようです。この実験の間、動物は台湾の国防医療センターの施設動物ケアとユーザー委員会によって維持された。
  6. 体重(マイクログラムバランスを用いて)、急性ウイルス性脳炎様疾患(セクション2に記載の疾患スコアリングによる)、および生存率9、10、11の観点からマウス日々進行状況を評価する ,12,13,14,15.

2. 疾患スコアリング

  1. 急性ウイルス性脳炎様疾患のグレードを監視します。健康なマウスにスコア 0 を割り当てます。1 減量、運動性の低下、およびハンチバック体の向きを含む軽度の病気の症状を持つマウス;2四肢発作を示すマウス;3マウスに、難易度および前肢または後肢の衰弱を伴う移動を含む、四肢の衰弱を示す。麻痺のための4;死亡は5
    注:スコアが3に達すると、疾患症状は急速に進化していると考えられる。
  2. ステップ2.1に従って、各グループの毎日のテストスコアの平均±SDを使用して、曲線ベースの図として毎日の疾患のスコアリングをプロットします。

結果

重度のデング熱関連神経合併症は、デング病因4の患者で報告されている。これらの症例は診療所では稀であるが、DENV感染の免疫能力を有するマウスモデルを作成することは、免疫病因の研究のためだけでなく、CNS感染、神経炎症、神経毒性、および急性ウイルスの探索にも使用できる。脳炎様性疾患。本研究では、現行モデル9、10、11、12、13、14、...

ディスカッション

DENV感染は重症デング熱患者3,17のCNSで検出されており、デング病因の間に急性ウイルス性脳炎の症状が起こった可能性を示唆している。ここでは、重篤なデング熱におけるCNS機能障害の関与を研究するためのDENV感染の生体内マウスモデルを報告し、特にDENV誘発性急性ウイルス性脳炎様疾患に焦点を当てた。前のモデルと比較して、特に1経路感染(?...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

本研究は、科学技術省(MOST107-2321-B-038-001)と台湾・台北市の106TMU-CIT-01-2の助成金によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)Gibco11875-085Diluting virus
0.3-mL Insulin Syringe BD Ultra-Fine­II328838Intracerebral and intraperitoneal injection
MicrobalanceMETTLER TOLEDO's LabXAL104Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)The Centers for Disease Control of Taiwan-Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouseBioLASCO Taiwan Co., Ltd-Our murine model

参考文献

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  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
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