JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для создания иммунокомпетентной Модели МЦР (Институт онкологических исследований) моринической модели инфекции центральной нервной системы для отображения развития невропатии. Мониторинг острых вирусных энцефалитических расстройств с одинаковыми показателями заболеваний может быть выполнен для показа вирусной нейропатии, вызванной вирусом денге in vivo.

Аннотация

Вирус денге (ДЕНВ), членистоногий вирус, передаваемый комарами, может вызывать тяжелое заболевание, известное как геморрагическая лихорадка денге, которая характеризуется смертельными осложнениями из-за утечки плазмы, асцита, плеврального выпота, дыхательного дистресса, сильное кровотечение и нарушение состояния органов. Несколько случаев заражения ДЕНВ представляют неврологические проявления; однако, исследования не исследовали DENV-индуцированный нейропатогенез далее. В этом исследовании мы представляем протокол для использования иммунокомпетентных выведенных МЦР (Институт исследований рака) мыши для исследования индукции центральной нервной системы (ЦНС) инфекции с DENV, а затем прогрессирование острого вирусного энцефалита, как Болезни.

Введение

DENV, членистоногий вирус семейства Flaviviridae, содержит геном РНК с положительным чувством, который кодирует три вирусных структурных белка (капсид, премембран и конверт) и семь вирусных неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , и NS5). Четыре серотипа DENV (DENV1-4), которые заражают около 390 миллионов человек ежегодно, вызывают глобальное бремя, хотя правительства направили значительные усилия на переносчика комаров и борьбы с болезнями1. В настоящее время защитные вакцины и терапевтические противовирусные препараты находятся в стадии разработки и требуют дальнейшей долгосрочной проверки2. В клинической практике, хотя пациент денге с инфекцией ЦНС встречается редко, его необходимо дополнительно изучить, чтобы понять разнообразие развития болезни денге3. Необходимы дальнейшие исследования и проверки; в частности, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) включила участие ЦНС нарушения, такие как когнитивные нарушения, судороги, энцефалопатия, и энцефалит, в классификации тяжелой денге3,4. Построение животных моделей инфекции DENV необходимо для изучения нейропатогенеза инфекции DENV.

Для генерации инфекции ЦНС DENV, несколько исследований выполнили различные маршруты инфекции DENV, в том числе (1) внутримозговая прививка C57BL/6 мышей, которые получили 4 х 103 бляшки формирования единиц (PFU) неадаптированных DENV35, 6, (2) интраперитонеальная прививка BALB/c мышей, которые получили 7 х 104 PFU в пробирке нейроадаптированных DENV47, (3) внутримозговая прививка швейцарских мышей, которые получили 1 х 105 PFU in vivo нейроадаптированных DENV1, 8, и (4) внутримозговая и интраперитонеальная ко-прививка МЦР сосание мышей, которые получили 1 х 106 PFU неадаптированных DENV29. Согласно выводам этих исследований5,6,7,8,9, DENV инфекции у мышей привести к вирусной репликации в головном мозге, что приводит к острой вирусной энцефалит-подобные синдромы, поведенческие изменения, сопровождающиеся параличом конечностей и постуральной нестабильностью, нейротоксичность ЦНС и воспаление, общая и локализованная утечка плазмы через гематоэнцефалический барьер (BBB), и летальность. Все результаты этих исследований5,6,7,8,9 показали способность DENV заразить ЦНС и индукции острого вирусного энцефалита, как болезни после инфекции.

Основываясь на наших текущих выводах9,10,11,12,13,14,15, мы создали модель мурин инфекции DENV как in vivo платформы для изучения терапевтической эффективности целевых агентов / факторов против репликации вируса, а также нейротоксичности. Здесь мы сообщаем протокол, используемый для создания иммунокомпетентной выведенной мыши ICR для изучения инфекции ЦНС и мониторинга развития невропатий с различными разрывами, вызванными DENV. Результаты показывают значительное прогрессирование энцефалита, как болезнь в DENV-инфицированных мышей в зависимости от времени образом.

протокол

Экспериментальные протоколы исследования животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и пользователями Национального оборонного медицинского центра (IACUC номер: 16-261), в соответствии с руководящими принципами, установленными Министерством науки и техники, Тайвань.

1. Процедура заражения

  1. Подготовка неадаптированных DENV2 (напряжение PL046) запасы9 (первоначально полученные из Центров по контролю заболеваний в Тайване, начиная от 2,5 х 107 до 1 х 109 PFU/mL).
  2. Разбавить вирусный запас до 1 х 106 PFU с Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 средних до общего объема 40 Зл.
  3. Заполните один шприц 0,3 мл, оснащенный иглой 30 Г с 10 л (2,5 х 105 ПФУ) разбавленного вируса, и заполните еще 0,3 мл шприца, оснащенного 30 G иглой с 30 Л (7,5 х 105 PFU) разбавленного вируса.
  4. Держите 7-дневную мышь ICR сосание и провести следующие шаги.
    1. Для внутримозговой инъекции держите мышь в склонном положении, нажав на ушную раковину между указательным пальцем и большим пальцем, и интрацерально впрысните 10 л. разбавленного вируса в область лямбды, точку на пересечении сагитального и лягчитедного шва 16.
    2. После внутримозговой инъекции держите мышь в положении на спине, используя указательный палец и большой палец и интраперитонеально впрысните 30 л разбавленного вируса в брюшную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать каннибализма, 75% алкоголя используется для создания временной потери обонятельных ощущений матери. Дополнительно, покрывать пометы с табуретом их мати и мочой предложено.
  5. Положите сосание мышей обратно в клетки и ждать 5 минут, чтобы проверить их безопасности постстимуляции с жадностью мышей, в том числе ходьба и материнское молоко сосание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чаще всего, мыши демонстрируют нормальную активность постстимуляции и, кажется, не будет каких-либо вредных эффектов после технической проблемы. В ходе этого эксперимента, животные были поддержаны институционального ухода за животными и пользователей комитета Национального медицинского центра обороны, Тайвань.
  6. Оцените ежедневный прогресс мышей с точки зрения массы тела (с помощью баланса микрограмма), острой вирусной энцефалита, как болезнь (по болезни скоринга, как описано в разделе 2), и выживаемость9,10,11 ,12,13,14,15.

2. Оценка болезней

  1. Мониторинг класса острых вирусных энцефалитных заболеваний. Назначить счет 0 для здоровых мышей; 1 для мышей с незначительными симптомами болезни, включая потерю веса, снижение подвижности, и ориентация горбуна тела; 2 для мышей, которые проявляют лимбический припадок; 3 для мышей выставки лимбической слабости, в том числе перемещение с трудом и передней конечности или задней слабости конечностей; 4 для паралича; 5 за смерть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только оценка достигает 3, симптомы болезни считаются быстро развивается.
  2. Участок скоринга болезни, в соответствии с шагом 2.1, для каждого дня, как кривая на основе фигуры, используя среднее SD ежедневных тестов в каждой группе.

Результаты

Тяжелые денге связанных неврологических осложнений были зарегистрированы у пациентов с денге патогенеза4. Хотя эти случаи редки в клинике, создание иммунокомпетентной модели минина инфекции DENV может быть использовано не только для изучения иммунопатог?...

Обсуждение

ДенВ-инфекция была обнаружена в ЦНС тяжелых пациентов денге3,17, что свидетельствует о возможности проявления острого вирусного энцефалита произошло во время патогенеза денге. Здесь мы сообщаем о модели in vivo murine инфекции ДЕНВ для изучения участия дисфунк...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Министерства науки и техники (MOST107-2321-B-038-001) и интрамуральным финансированием 106TMU-CIT-01-2, Тайбэй, Тайвань.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)Gibco11875-085Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe BD Ultra-Fine­II328838Intracerebral and intraperitoneal injection
MicrobalanceMETTLER TOLEDO's LabXAL104Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)The Centers for Disease Control of Taiwan-Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouseBioLASCO Taiwan Co., Ltd-Our murine model

Ссылки

  1. Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055 (2016).
  2. Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
  3. Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
  4. Geneva: World Health Organization. . Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , (2009).
  5. Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
  6. de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
  7. Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
  8. Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
  9. Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
  10. Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
  11. Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910 (2017).
  12. Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
  13. Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715 (2018).
  14. Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
  15. Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91 (2017).
  16. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
  17. Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
  18. Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
  19. Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
  20. Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
  21. Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
  22. Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
  23. Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
  24. Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
  25. Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

146Murine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены