מודל Murine של וירוס דנגה-הנגרמת חריפה דלקת קרום המוח-כמו מחלה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת ICR מוסמך (המכון לחקר הסרטן) מודל murine של זיהום מערכת העצבים המרכזית כדי להציג את ההתפתחות של נוירופתיה. ניטור ויראלי חריפה הפרעות נצאליטיות על ידי עשרות מחלה זהה יכול להתבצע על מראה דנגי וירוס המושרה נוירופתיה ב vivo.

Abstract

וירוס דנגה (DENV), וירוס המועבר על-ידי היתושים המועברים על ידי יתוש, עלול לגרום למחלה חמורה הידועה בשם קדחת דנגה מדמם, אשר מאופיין על ידי סיבוכים קטלניים עקב דליפת פלזמה, מיימת, היתוך, מצוקה נשימתית, . דימום חמור וליקוי איברים כמה מקרים של זיהום DENV להציג ביטויים נוירולוגיים; עם זאת, מחקרים לא חקרו באופן נוירופתוגנזה המושרה של DENV יותר. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להשתמש חיסוני מוסמך ICR (המכון לחקר הסרטן) העכבר לחקירת אינדוקציה של מערכת העצבים המרכזית (CN) זיהום עם DENV, ואחריו את ההתקדמות של דלקת קרום המוח נגיפי חריפה כמו מחלה.

Introduction

DENV, וירוס המועברות על ידי משפחת פליורידיי , מכיל גנום ה-RNA הגיוני מקודד שלושה חלבונים מבניים נגיפי (capsid, טרום קרום, מעטפה) ו שבעה חלבונים לא מבניים ויראלי (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B , ו-NS5). ארבעת סוגי הסרווים של DENV (DENV1-4), אשר להדביק כ 390,000,000 אנשים מדי שנה, לגרום נטל גלובלי אף על פי ממשלות ביים מאמצים משמעותיים לקראת וקטור יתושים ושליטה מחלות¹. כיום, חיסונים להגנה ותרופות אנטי-ויראליות טיפוליות בשלבי פיתוח ודורשות אימות לטווח ארוך יותר². בתחום הקליני, למרות חולה דנגה עם זיהום של ה-CN הוא נדיר, זה צריך להיות בחקר נוסף כדי להבין את הגיוון של פיתוח מחלת דנגה³. יש צורך בחקירה ובאימות נוספים; בעיקר, ארגון הבריאות העולמי (אשר) כלל את המעורבות של ליקוי המוח, כגון ליקוי קוגניטיבי, עוויתות, אנצפלופתיה, ודלקת קרום המוח, בסיווג חמור דנגה^3,4. בניית מודלים בעלי חיים של זיהום DENV היא הכרחית לחקר נוירופתוגנזה של זיהום DENV.

ליצירת זיהום ה-CN של DENV, מספר מחקרים ביצעו מסלולים שונים של זיהום DENV, כולל (1) גרם חיסונים של C57BL/6 עכברים שקיבלו 4 x 10³ פלאק-להרכיב יחידות (pfu) של DENV3 המותאם ל^{5, 6}, (2) הצפק פנימי של עכברים balb/c שקיבלו 7 x 10⁴ pfu של מבחנה נוירומותאמת DENV4⁷, (3) גרם החיסון של עכברים שוויצריים שקיבלו 1 x 10⁵ pfu של vivo neuroadapted DENV1⁸, ו (4) גרם ו-הצפק משותפת של עכברי מוצצים ICR שהתקבלו 1 x 10⁶ pfu של לא מותאם DENV2⁹. על פי ממצאי מחקרים אלה^5,6,7,8,9, הזיהום denv בעכברים התוצאה שכפול נגיפי במוח, המוביל נגיפי חריפה תסמונות של דלקת קרום המוח, שינויים התנהגותיים מלווים בשיתוק איברים וחוסר יציבות, מערכת העצבים העצבית והדלקת, דליפת פלזמה כללית ומקומית באמצעות מחסום הדם-מוחי (BBB) וללא השפעה. כל התוצאות ממחקרים אלה^5,6,7,8,9 הראו את היכולת של denv להדביק את המוח ואת אינדוקציה של דלקת קרום המוח הנגיפי חריפה כמו מחלה לאחר הידבקות.

בהתבסס על הממצאים הנוכחיים שלנו^9,10,11,^12,13,14,15, יצרנו מודל murine של זיהום denv כמו ב vivo פלטפורמה כדי לבחון את היעילות הטיפולית של סוכני ממוקדות/גורמים נגד שכפול נגיפי, כמו גם רעילות נוירו. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מנוצל כדי ליצור העכבר icr מוסמך החוצה כדי ללמוד זיהום של הפונקציה וכלה לפקח על פיתוח נזקי עם הרבה הקצבאות שנגרמו על ידי denv. התוצאות מציגות את ההתקדמות המשמעותית של המחלה כמו דלקת קרום המוח בעכברים נגועים DENV באופן תלוי זמן.

Protocol

פרוטוקולים ניסיוניים של מחקר בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדת המשתמש של המרכז הרפואי הביטחון הלאומי (מספר IACUC: 16-261), על פי ההנחיות שנקבעו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן.

1. הליך זיהום

1. להכין DENV2 לא מותאם (זן PL046) מניות⁹ (התקבל במקור מן המרכזים לבקרת מחלות בטייוואן, החל 2.5 x 10⁷ אל 1 x 10⁹ pfu/mL).
2. לדלל את המניה וירוס 1 x 10⁶ pfu עם רוזוול פארק הזיכרון מכון (RPMI) 1640 בינוני לנפח הכולל של 40 μl.
3. מילוי מזרק אחד 0.3 mL מצויד עם מחט של 30 גרם עם 10 μL (2.5 x 10⁵ pfu) של וירוס מדולל, ולמלא 0.3 עוד מזרק מדגם mL מצויד במחט 30 G עם 30 μl (7.5 x 10⁵ pfu) של וירוס מדולל.
4. להחזיק את 7 יום בן היניקה העכבר ICR ולנהל את השלבים הבאים.
   1. עבור הזרקת גרם, להחזיק את העכבר בתנוחה נוטה על ידי לחיצה על מאורקל בין האצבע המדד והאגודל, ו תאיים להזריק 10 μL של וירוס מדולל לאזור למדא, הנקודה בהצטלבות של משונן ותפר למדוגת . ^{שישה עשרה}
   2. לאחר הזרקת גרם, להחזיק את העכבר במצב פרקדן באמצעות האצבע המדד והאגודל ו intraperitoneally להזריק 30 μl של וירוס מדולל בעדינות לתוך הabdomenl murine.
      הערה: כדי להימנע מקניבליזם, 75% אלכוהול משמש ליצירת אובדן זמני של תחושת הריח של האם. בנוסף, הציע לכסות את הציפוי בצואה ובשתן של אימם.
5. הניחו את עכברי היניקה בחזרה בכלובים שלהם והמתינו 5 דקות כדי לבדוק את בטיחות הגירוי שלהם עם האוויקות של עכברים, כולל הליכה וחלב אם יניקה.
   הערה: לרוב, עכברים להפגין הגירוי הרגיל של פעילות הפוסט, אין נראה כל השפעות מזיקות בעקבות האתגר הטכני. במהלך ניסוי זה, החיות היו מתוחזקים על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים וועדת המשתמש של המרכז הרפואי הביטחון הלאומי, טייוואן.
6. להעריך את ההתקדמות היומית של העכברים במונחים של משקל הגוף (באמצעות איזון יקרוגרם), מחלה נגיפית חריפה של דלקת קרום המוח (על ידי מחלה הבקיע כפי שמתואר בסעיף 2), ושיעור ההישרדות^{9,10,11 ,12,13,14,15}.

2. ניקוד מחלות

1. לעקוב אחר כיתה של דלקת קרום המוח הנגיפית חריפה כמו. הקצאת ניקוד של 0 לעכברים בריאים; 1 לעכברים עם תסמיני מחלה קלה, כולל ירידה במשקל, ניידות מופחתת וכיוון גוף הגיבן; 2 לעכברים המוצגים התקף ללימבי; 3 לעכברים את החולשה הלימבית התערוכה, כולל נע עם קושי האיבר הקדמי או חולשה האיבר האחורי; 4 לשיתוק; . חמש למוות
   הערה: לאחר הניקוד מגיע 3, תסמיני המחלה נחשבים להתפתח במהירות.
2. להתוות את הניקוד של המחלה, על פי שלב 2.1, עבור כל יום כדמות עקומה מבוססת באמצעות ממוצע ± SD של תוצאות המבחן היומי בכל קבוצה.

תוצאות

חמור קדחת דנגה הקשורים סיבוכים נוירולוגיים דווחו בחולים עבור פתוגנזה דנגה⁴. למרות המקרים האלה הם נדירים במרפאה, יצירת מודל מורלא מוסמך של זיהום DENV ניתן להשתמש לא רק לימוד immunopathogenesis אלא גם לחקירת זיהום של הפונקציה, נוירודלקת, נוירורעילות, ו ויראלי חריפה מחלה ?...

Discussion

הזיהום denv זוהה ב-cn של מטופלים חמורים דנגה^3,17, מציע את האפשרות של ביטוי של דלקת קרום המוח נגיפי חריפה התרחשה במהלך פתוגנזה דנגה. כאן, אנו מדווחים על מודל vivo murine של זיהום DENV לחקר מעורבות של התפקוד העצמי של ה-CN דנגה, במיוחד עם דגש על DENV המושרה דלקת קרום המוח ויראלי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)	Gibco	11875-085	Diluting virus
0.3 mL Insulin Syringe	BD Ultra-Fine­II	328838	Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance	METTLER TOLEDO's LabX	AL104	Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)	The Centers for Disease Control of Taiwan	-	Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse	BioLASCO Taiwan Co., Ltd	-	Our murine model