Ein murines Modell der Dengue-Virus-induzierten akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen Krankheit

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Schaffung eines immunkompetenten ICR (Institute of Cancer Research) murinen Modells der Infektion des zentralen Nervensystems vor, um die Entwicklung der Neuropathie anzuzeigen. Die Überwachung akuter viraler Enzephalit-Erkrankungen durch identische Krankheitswerte könnte durchgeführt werden, um die dengue-Virus-induzierte Neuropathie in vivo zu zeigen.

Zusammenfassung

Dengue-Virus (DENV), ein durch Gliederfüßer übertragenes Virus, das von Mücken übertragen wird, kann die schwere Krankheit, die als Dengue-Hämorrhagisches Fieber bekannt ist, verursachen, die durch tödliche Komplikationen aufgrund von Plasmalecks, Aszites, Pleuraerguss, Atemnot, schwere Blutungen und Organfunktionsstörungen. Einige Fälle von DENV-Infektion enden neurologische Manifestationen; Studien haben jedoch die DENV-induzierte Neuropathogenese nicht weiter erforscht. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Verwendung einer immunkompetenten outbred ICR (Institute of Cancer Research) Maus zur Untersuchung der Induktion der Infektion des zentralen Nervensystems (ZNS) mit DENV, gefolgt von der Progression der akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen krankheit.

Einleitung

DENV, ein durch Arthropoden übertragenes Virus der Familie Flaviviridae, enthält ein positiv-sinnliches RNA-Genom, das drei virale Strukturproteine (Capsid, Premembrane und Hüllkurve) und sieben virale nichtstrukturelle Proteine (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B) kodiert. und NS5). Die vier Serotypen von DENV (DENV1-4), die jährlich etwa 390 Millionen Menschen infizieren, verursachen eine globale Belastung, obwohl die Regierungen erhebliche Anstrengungen in Richtung Mückenvektor und Krankheitsbekämpfung unternommen haben¹. Derzeit befinden sich Schutzimpfstoffe und therapeutische antivirale Medikamente in der Entwicklung und erfordern eine weitere Langzeitvalidierung². In der klinischen Praxis, obwohl ein Dengue-Patient mit ZNS-Infektion selten ist, muss es weiter erforscht werden, um die Vielfalt der Entwicklung der Dengue-Krankheit zu verstehen³. Weitere Untersuchungen und Validierungen sind erforderlich; insbesondere hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) die Einbeziehung von ZNS-Beeinträchtigungen wie kognitiven Beeinträchtigungen, Krämpfen, Enzephalopathie und Enzephalitis in die Klassifizierung schwerer Dengue-3^,4aufgenommen. Die Erstellung von Tiermodellen der DENV-Infektion ist für die Erforschung der Neuropathogenese der DENV-Infektion unerlässlich.

Zur Generierung einer ZNS-Infektion durch DENV wurden in mehreren Studien verschiedene Wege der DENV-Infektion durchgeführt, darunter (1) intracerebrale Inokulation von C57BL/6-Mäusen, die 4 x 10³ Plaque-bildende Einheiten (PFU) von nicht angepassten DENV3⁵erhielten. ⁶, (2) intraperitoneale Impfung von BALB/c-Mäusen, die 7 x 10⁴ PFU in vitro neuroangepassten DENV4⁷, (3) intraceebrale Impfung von Schweizer Mäusen erhielten, die 1 x 10⁵ PFU in vivo neuroangepassten DENV1⁸erhielten, und (4) intraperitoneale Ko-Inokulation von ICR-Säugenmäusen, die 1 x 10⁶ PFU nicht angepassten DENV2⁹erhielten. Nach den Ergebnissen dieser Studien^5,6,7,8,9, DENV-Infektion bei Mäusen führen zu einer Viralreplikation im Gehirn, was zu akuten viralen Enzephalitis-ähnliche Syndrome, Verhaltensänderungen begleitet von Gliedmaßenlähmung und Haltungsinstabilität, ZNS-Neurotoxizität und -entzündung, allgemeine und lokalisierte Plasmaleckage durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) und Letalität. Alle Ergebnisse dieser Studien^5,6,7,8,9 haben die Fähigkeit von DENV gezeigt, das ZNS zu infizieren und die Induktion von akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen Krankheit nach einer Infektion.

Basierend auf unseren aktuellen Erkenntnissen^{9,10,11,12,13,14,15}, haben wir ein murines Modell der DENV-Infektion als in vivo erstellt Plattform, um die therapeutische Wirksamkeit gezielter Wirkstoffe/Faktoren gegen Die Virusreplikation sowie die Neurotoxizität zu untersuchen. Hier berichten wir über das Protokoll, das verwendet wurde, um eine immunkompetente outbred ICR-Maus zu erstellen, um ZNS-Infektionen zu untersuchen und die Entwicklung von Neuropathien mit unterschiedlichen Schweregraden zu überwachen, die durch DENV verursacht werden. Die Ergebnisse zeigen das signifikante Fortschreiten der Enzephalitis-ähnlichen Krankheit bei DENV-infizierten Mäusen zeitabhängig.

Protokoll

Experimentelle Protokolle der Tierstudie wurden vom Institutional Animal Care and User Committee des National Defense Medical Center (IACUC-Nummer: 16-261) gemäß den Richtlinien des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, Taiwan, genehmigt.

1. Infektionsverfahren

1. Bereiten Sie nicht angepasste DENV2 (Stamm PL046) Bestände⁹ (ursprünglich von den Centers for Disease Control in Taiwan erhalten, im Bereich von 2,5 x 10⁷ bis 1 x 10⁹ PFU/ml).
2. Verdünnen Sie den Virusbestand auf 1 x 10⁶ PFU mit dem Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mittel bis zu einem Gesamtvolumen von 40 l.
3. Füllen Sie eine 0,3 ml Spritze, die mit einer 30 G-Nadel mit 10 l (2,5 x 10⁵ PFU) verdünntem Virus ausgestattet ist, und füllen Sie eine weitere 0,3 ml Spritze, die mit einer 30 G-Nadel mit 30 l (7,5 x 10⁵ PFU) verdünntem Virus ausgestattet ist.
4. Halten Sie die 7 Tage alte ICR-Säuge maus und führen Sie die folgenden Schritte.
   1. Halten Sie die Maus für die intracerebrale Injektion in eine anfällige Position, indem Sie die Ohrmuschel zwischen Zeigefinger und Daumen drücken, und intracerebral 10 l verdünntes Virus in den Lambda-Bereich injizieren, den Punkt an der Kreuzung der sagittalen und lambdoiden Naht ¹⁶.
   2. Halten Sie die Maus nach der intracerebralen Injektion mit Deminzfinger und Daumen in eine Supine-Position und injizieren Sie 30 L verdünntes Virus sanft in das murine Abdomenl.
      HINWEIS: Um Kannibalismus zu vermeiden, wird 75% Alkohol verwendet, um einen vorübergehenden Verlust des Geruchsempfindens der Mutter zu schaffen. Zusätzlich wird empfohlen, die Würfe mit dem Stuhl und Urin ihrer Mutter zu bedecken.
5. Legen Sie die Säugenmäuse wieder in ihre Käfige und warten Sie 5 min, um ihre Sicherheitspoststimulation mit der Eifersucht der Mäuse zu überprüfen, einschließlich Gehen und Muttermilchsaugen.
   HINWEIS: Meistens zeigen Mäuse eine normale Aktivität spoststimulation und es scheint keine schädlichen Auswirkungen nach der technischen Herausforderung zu sein. Während dieses Experiments wurden die Tiere vom Institutional Animal Care and User Committee des National Defense Medical Center, Taiwan, gepflegt.
6. Bewerten Sie den täglichen Fortschritt der Mäuse in Bezug auf das Körpergewicht (mit Hilfe eines Mikrogramm-Gleichgewichts), die akute virale Enzephalitis-ähnliche Erkrankung (durch Krankheitsbewertung wie in Abschnitt 2 beschrieben) und die Überlebensrate^{9,10,11 ,12,13,14,15}.

2. Krankheitsbewertung

1. Überwachen Sie den Grad der akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen Erkrankungen. Weisen Sie gesunden Mäusen eine Punktzahl von 0 zu; 1 an Mäuse mit leichten Krankheitssymptomen, einschließlich Gewichtsverlust, eingeschränkter Beweglichkeit und einer Glöckungs-Körperorientierung; 2 an Mäuse, die einen limbischen Anfall aufweisen; 3 an Mäuse zeigen die limbische Schwäche, einschließlich der Bewegung mit Schwierigkeiten und vorderen Gliedmaßen oder hintere Gliedmaßen Schwäche; 4 für Lähmung; 5 für den Tod.
   HINWEIS: Sobald die Punktzahl 3 erreicht, werden die Krankheitssymptome als schnell entwickelnd betrachtet.
2. Zeichnen Sie die Bewertung der Krankheit, nach Schritt 2.1, für jeden Tag als kurvenbasierte Figur, indem Sie den Mittelwert sD der täglichen Testergebnisse in jeder Gruppe verwenden.

Ergebnisse

Schwere Dengue-assoziierte neurologische Komplikationen wurden bei Patientenfür Dengue-Pathogenese 4 berichtet. Obwohl diese Fälle in der Klinik selten sind, kann die Schaffung eines immunkompetenten murinen Modells der DENV-Infektion nicht nur zur Untersuchung der Immunpathogenese, sondern auch zur Erforschung von ZNS-Infektionen, Neuroentzündungen, Neurotoxizität und akuten viralen Enzephalitis-ähnliche Krankheit. In dieser Studie wurden nach unserem aktuell...

Diskussion

Die DENV-Infektion wurde im ZNS von schweren Dengue-Patienten^3,17nachgewiesen, was auf die Möglichkeit der Manifestation der akuten viralen Enzephalitis während der Dengue-Pathogenese hindeutet. Hier berichten wir über ein in vivo murines Modell der DENV-Infektion zur Untersuchung der Beteiligung von ZNS-Dysfunktion an schwerem Dengue- und Insbesondere mit einem Fokus auf DENV-induzierte akute virale Enzephalitis-ähnliche Erkrankungen. Im Vergleich zu den vor...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)	Gibco	11875-085	Diluting virus
0.3-mL Insulin Syringe	BD Ultra-Fine­II	328838	Intracerebral and intraperitoneal injection
Microbalance	METTLER TOLEDO's LabX	AL104	Weight mouse
Non-adapted DENV2 (strain PL046)	The Centers for Disease Control of Taiwan	-	Infect mouse
Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse	BioLASCO Taiwan Co., Ltd	-	Our murine model