عزل ماليجنانت وعدم ماليجنانت ب الخلايا من lck:eGFP الزرد

Summary

الزرد المعدلة وراثيا lck:eGFP التعبير عن بروتينات فلورية خضراء عالية في الخلايا اللمفية تي، وقد استخدمت لدراسة التنمية الخلية T، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد. يمكن استخدام هذا الخط للدراسة ب الخلايا، التي تعبر عن لك في المستويات الدنيا. ويصف هذا البروتوكول تنقية الخلايا ب الخبيثة وغير الخبيثة من الزرد lck:eGFP .

Abstract

الزرد (دانيو rerio) نموذج قوي لدراسة التنمية اللمفاويات. مثل الثدييات، تمتلك ريريو دال- المناعي التكيفي يشمل الخلايا الليمفاوية B و T. دراسات ليمفوبويسيس الزرد صعبة لأن الأجسام المضادة للاعتراف بعلامات سطح خلية ريريو دال- لا تتوافر عموما، تعقيد عزل وتوصيف للسكان اللمفاويات مختلفة، بما في ذلك النسب ب الخلايا. وكثيراً ما تستخدم خطوط المحورة وراثيا مع التعبير فلوروفوري الخاصة بالنسب للتحايل على هذا التحدي. السطر المعدلة وراثيا lck:eGFP قد استخدمت لدراسة التنمية الخلية تي ريريو دال ، وقد استخدمت أيضا لنموذج التنمية الخلية T وسرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-الكل). على الرغم من أن الأسماك lck:eGFP قد استخدمت على نطاق واسع لتحليل T-النسب، فلا قد استخدمت لدراسة الخلايا باء. في الآونة الأخيرة، اكتشفنا أن العديد من الزرد ب الخلايا أيضا التعبير عن لك، أن كان ذلك في المستويات الدنيا. ونتيجة لذلك، وبالمثل الخلايا lck:eGFP ب التعبير عن المستويات المنخفضة للتجارة والنقل. وبناء على هذا الاستنتاج، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية الخلايا ب-النسب من الزرد lck:eGFP ، الذي يقدم لنا هنا. لدينا طريقة توضح كيفية الاستفادة خلية تنشيط الفلورسنت فارز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتنقية الخلايا ب من أسماك lck:eGFP أو خطوط ذات الصلة، مثل rag2:hMYCمن المعدلة وراثيا مزدوجة؛ سمكة lck:eGFP . في هذه الأسطر، ب الخلايا، خلايا ب خاصة غير ناضجة، التعبير عن التجارة والنقل على مستويات منخفضة ولكن يمكن كشفها، السماح لهم بأن تميز من خلايا تي، التي تعبر عن بروتينات فلورية خضراء عالية. يمكن أن تكون الخلايا ب المعزولة من نخاع الغدة الصعترية، والطحال، والدم أو الأنسجة الأخرى. هذا البروتوكول يوفر طريقة جديدة لتنقية الخلايا ب ريريو دال ، تمكين الدراسات ركزت على مواضيع مثل التنمية الخلية ب وب اللمفاويات الأورام الخبيثة.

Introduction

وتقدم الزرد سمات قوية، مثل مانيبولابيليتي الجينية والخصوبة العالية والشفافية الضوئية والتنمية السريعة التي تسهل التنمية الفقاريات دراسة استخدام النهج الوراثية. هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع الميزات المشتركة من هيماتوبويسيس تيليوست والثدييات، جعل ريريو دال- مثالية للتحليلات المجراة في الدالة ليمفوبويسيس واللمفاويات، من مظهرها أقرب في اليرقات طوال مرحلة البلوغ. يعتمد وضع الدم في الزرد مصانة جيدا العمليات الجينية المشتركة مع الثدييات، وهذه تشمل المناعي التكيفي. بالإضافة إلى ذلك، يحافظ الآليات الجزيئية التي تحكم التنمية اللمفاوية هي ملحوظ بين الزرد والثدييات¹.

على مدى العقدين الماضيين، المعدلة وراثيا ريريو دال- خطوط الأنساب الدم محددة تسمية هذا وتم إنشاء خطوط المسخ ناقص في هذه الأنساب^2،3،،من⁴⁵. واحدة من هذه، السطر المعدلة وراثيا lck:eGFP ، يستخدم الزرد اللمفاويات بروتين تيروزين كيناز (لك) المروج لمحرك بروتينات فلورية خضراء التعبير⁶. ويسمح هذا الجين، التي يعبر عنها درجة عالية من السلائف تي-النسب والخلايا الليمفاوية T الناضجة، المجراة في تتبع التنمية الغدة الصعترية T الخلية والسابقين فيفو تنقية خلايا T-النسب بنظام مراقبة الأصول الميدانية⁷. سابقا، استخدمنا هذا الخط في شاشة ENU الطفرات وراثية إلى الأمام لتحديد طفرات germline المعرضة إلى T-جميع ودراسة الأحداث الوراثية المكتسبة سوماتيكالي مرتبطة بخلية T أونكوجينيسيس^8،9.

في الآونة الأخيرة، تمديد مختبرنا فائدة الزرد lck:eGFP . في المعدلة وراثيا مزدوج rag2:hMYC (حركة البشرية)، ريريو دال lck:eGFP المعروفة بتطوير جميع تي ¹⁰، اكتشفنا أن النسب ب كل ما يحدث أيضا¹¹. على عكس جميع تي في هذا النموذج الذي فلوريس الزاهية بسبب ارتفاع بروتينات فلورية خضراء التعبير، ب-جميع الخافتة فلوري بسبب انخفاض مستويات التجارة والنقل، مما يتيح الأسماك مع الجميع ب ينبغي تمييز صارخ من تلك مع تي للجميع مجهر فلوري. هذا التعبير بروتينات فلورية خضراء التفاضلية كما يسمح الفصل بين التجارة والنقل^{، لو} ب-جميع الخلايا من بروتينات فلورية خضراء^مرحبا تي-جميع الخلايا باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية¹¹. وعلاوة على ذلك، التعبير منخفضة لك ليست فريدة من نوعها الزرد ب للجميع، الإنسان ب-جميع أيضا التعبير عن تدني مستويات لك^11،12. وبالمثل، أعرب الخلايا ب-النسب الطبيعية ريريو دال، والفئران والبشر أيضا مستويات منخفضة من لك/لك/لك، مع خلايا ب غير ناضجة بعد^11،التعبير أعلى¹³. على أساس كل خلية، أعرب الخلايا ب-النسب في خطوط الزرد أو مشتقات لكيجفب 1-10 ٪ قدر بروتينات فلورية خضراء كالخلايا اللمفية تي. هذه التجارة والنقل^لو خلايا مميزة صراحة مرناس بالخليه مثل pax5، cd79b، بلنك، btk، إيغم، إيغز، وغيرهم، ويمكن تنقيته من نخاع الغدة الصعترية, الطحال أو الطرفية ¹¹من الدم. ولذلك، كلا ب-و T-النسب يمكن أن تكون الخلايا المعزولة من الزرد لكيجفب ، وفي حالة rag2hMYC، لكيجفب الحيوانات، والخلايا ب-T جميع وكذلك¹¹.

هنا، نقدم لدينا بروتوكول لكفاءة تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية غير-ب الخلايا الخبيثة من الزرد lck:eGFP ، والخلايا ب غير خبيث أو خبيث من rag2hMYC؛ lck:eGFP الأسماك، باستخدام أنسجة مصدر مختلفة. وبالمثل يمكن قياس هذه الخلايا بالتدفق الخلوي دون عزل نظام مراقبة الأصول الميدانية، إذا رغبت في ذلك. اكتشاف انخفاض لك التعبير-ونتيجة لذلك، منخفضة تعبير بروتينات فلورية خضراء-ب الخلايا يفتح أبواباً جديدة من الاحتمالات التجريبية لكيجفب الزرد، مثل الخلية في فيفو ب الدراسات الإنمائية. وهكذا، قد هذا الخط المحورة وراثيا، ذكرت أول مرة في عام 2004، حياة جديدة ونحن نسعى إلى الاستفادة منها استخلاص أفكار جديدة بشأن الحصانة التكيفية الزرد.

Protocol

بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الزرد "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مركز العلوم الصحية في جامعة أوكلاهوما.

1-عزل ب عدم الخبيثة والخلايا الليمفاوية T من المعدلة وراثيا lck:eGFP الأسماك

1. تخدير الأسماك استخدام تريكيني 0.02% (MS-222) في الأسماك نظام المياه.
2. فحص الأسماك 2-6 شهرا الفلورسنت تيمي، التي تقع في الجانب دورسوميديال في تجويف التطور الزرد وغيرها اريوكروماس¹⁴. استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي (470/40 الطول الموجي الإثارة وتصفية الانبعاثات 525/50) للكشف عن التجارة والنقل.
3. إعداد مقدما 50 مل من تصفية تعقيم 1 × روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) التي تحتوي على 1% الجنين البقري المصل و 1% البنسلين-ستربتوميسين (الفرز وسائل الإعلام). ويمكن تخزين وسائط غير مستخدمة الفرز عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
4. Euthanize السمك بوضعه في كوب يحتوي على 0.2% تريكيني لمدة حوالي 5 دقائق، تليها الغمر حمام الثلج. تأكيد وفاة بوقف حركة أوبيركولار (جيل).
5. ضع السمك يوثانيزيد في طبق بتري وتشريح الأجهزة اللمفاوية للفائدة، باستخدام مجهر فلوري تشريح تيمي بروتينات فلورية خضراء^{+ 14}، وإعدادات الحقل مشرق الفحص المجهري تشريح النخاع والطحال الكلي¹⁵. وتحققت النتائج المعروضة هنا باستخدام 3 أشهر الأسماك. نسب اللمفاويات والأرقام المطلقة تختلف حسب العمر والتركيب الوراثي (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل).
6. ضع كل جهاز تشريح في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر من البرد الفرز وسائط الإعلام.
7. مجانسة الأنسجة على استخدام الخالطون الصغرى-أنبوب مدقة الجليد.
8. يمر النسيج المتجانس عامل تصفية شبكة 35 ميكرون لتوليد تعليق خلية مفردة. تبقى الخلايا على الجليد حتى التحليل.

2-عزل الخلايا الليمفاوية الخبيثة من المعدلة وراثيا مزدوج rag2:hMYC؛ lck:eGFP الزرد

1. ابتداء من 2-4 أشهر، مجهريا الشاشة rag2:hMYC؛ lck:eGFP الأسماك لأنماط التجارة والنقل غير طبيعي.
   ملاحظة: ب الخلايا هي التجارة والنقل^{، لو} في الخلفية lck:eGFP ، حيث ب للجميع يتطلب ممارسة الاعتراف؛ T-جميع من الواضح، نظراً لأن خلايا تي التجارة والنقل^مرحبا. ونتيجة لذلك، rag2:hMYC، lck:eGFP الخط المزدوج وراثيا قد تعمل اثنين: الزاهية فلوري تي-جميع، التي عادة ما تنشأ من الغدة الصعترية وتمتد إلى الجسم، والخافتة فلوري ب-جميع.
   1. استخدام مجهر فلوري، الشاشة الأسماك باستخدام إعدادات "التعرض المنخفضة" (200 مرض التصلب العصبي المتعدد، كسب 2.4 x) لتحديد مشرق تي للجميع (الشكل 1A) و "عالية التعرض" (1.5 s، كسب 3.4 x) لتحديد خافت للجميع ب (الشكل 1A). وقد يتحكم بالوزن والسمك ليوكيميك قبل بروتينات فلورية خضراء المترجمة فقط في الغدة الصعترية (الشكل 1B).
2. تخدير وفحص الأسماك كما هو موضح في الخطوات 1، 1، 1-2.
3. تصنيف الأسماك استناداً إلى مدى fluorescence التجارة والنقل، باستخدام نظام ثلاث من فئة بسيطة:
   ملاحظة: مستوى 1: Fluorescence يظهر ورم الغدة الصعترية مع انتشار المحلية محدودة فقط.
   مستوى 2: يظهر الأسفار خارج الغدة الصعترية، التي تشمل < 50% الجسم.
   مستوى 3: Fluorescence تتجاوز 50% الجسم.
4. فصل الأسماك مع كل من تلك دون السرطان. رصد الأسماك ليوكيميك مسبقاً (أي، الأسماك دون أورام بروتينات فلورية خضراء⁺ ) مرة واحدة شهريا لوضع كل جديد. ~ 9 أشهر، كل rag2:hMYC، وضع الأسماك lck:eGFP تي للجميع، كل ب، أو كليهما.
5. T أو ب كل خلية العزلة، حدد مستوى 3 الأسماك (التي تشمل جميع > 50% الجسم)، مما يسفر عن أكثر من 2 × 10⁶ كافة الخلايا، وعادة الكثير.
6. Euthanize الأسماك كما في الخطوة 1، 4.
   ملاحظة: هناك طريقتان للحصول على كافة الخلايا: الجسم كله التجانس و تقنية غسيل البريتوني¹⁶. تختلف الطرق في العدد المطلق للخلايا التي يتم جمعها للفرز، وهكذا، الكميات من نظام مراقبة الأصول الميدانية الوقت المطلوب والتكاليف (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل).
7. أما الأسلوب، أولاً ضع الأسماك يوثانيزيد في طبق بتري واستخدام شفرة حلاقة، إزالة الرأس بما في ذلك منطقة الغدة الصعترية. وهذا يمكن معالجته بشكل منفصل، إذا رغبت، أو تستخدم لتلطيخ نسيجية.
8. طريقة الغسيل البريتوني
   1. استخدام ماصة P1000، يغسل التجويف الصفاقى الأسماك مع 500 ميليلتر من البرد الفرز وسائط الإعلام، وجمع الخلايا ووسائط الإعلام في أنبوب 5 مل.
   2. استخدام تلميح ماصة طازجة، حقن ميليلتر إضافية 200-300 من وسائل الإعلام الفرز الباردة في تجويف الجسم. ثم قم باستخدام تلميح الماصة، تطبيق ضغط لطيف على الجسم الأسماك لقذف الخلايا خارج تجويف الجسم. جمع هذه الوسائط، وإضافة إلى الأنبوب 5 مل.
   3. كرر الخطوة 2.8.2 2 – 3 مرات. تبقى الخلايا التي تم جمعها في فرز وسائل الإعلام على الجليد.
   4. تصفية تعليق خلية على الرغم من 35 ميكرون تصفية قبل التدفق الخلوي/نظام مراقبة الأصول الميدانية وإبقاء الخلايا على الجليد حتى التحليل.
9. تجانس الجسم كله
   1. بعد إزالة رأس السمك، ضع الجسم في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 200 ميليلتر لفرز وسائل الإعلام.
   2. مجانسة نص باستخدام الخالطون الصغرى-أنبوب مدقة.
   3. إضافة ميليلتر 300 إضافية من البرد الفرز وسائط الإعلام. تصفية تعليق الخلية على الرغم من أن عامل تصفية شبكة 35 ميكرون. إضافة وسائط الفرز حسب الحاجة لغسل كافة الخلايا عن طريق التصفية، حتى تبقى فقط الأنسجة الحطام على التصفية. تبقى الخلايا على الجليد حتى التحليل.

3-سيتوميتريك تحليل الخلايا الليمفاوية ب العادي أو خبيثة

1. تعيين تحليل تدفق سيتوميتريك و/أو معلمات نظام مراقبة الأصول الميدانية وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.
2. الحصول على العدد المطلوب من الأحداث في البداية وصف العينة. تحليل 1 × 10⁴ إلى 5 × 10⁴ الأحداث قبل الفرز لتحديد منافذ محددة لخطوات الفرز اللاحقة.
   1. تحديد بوابات: تعريف بوابات الخلية اللمفاويات والسلف باستخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) ومعلمات مبعثر (SSC) الجانب، باستثناء الحطام الخلوية (الشكل 2 أ-ج)¹⁷. منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب تتوافق مع حجم الخلية/القطر والتفاصيل، على التوالي.
      ملاحظة: ^–التجارة والنقل والتجارة والنقل^{، لو}وبروتينات فلورية خضراء^مرحبا خلايا تختلف 10-إلى-100-إضعاف من حيث قوتها fluorescence بروتينات فلورية خضراء، مما يجعل الفصل بين هؤلاء السكان مباشرة (الأرقام 2-5). ويمكن تقييم التمييز الميت يعيش في هذه المرحلة باستخدام اليود propidium (PI) أو 7-أمينواكتينوميسين د (7-اعتبر) صلاحية تلطيخ. عادة ما تثبت التجارب السابقة مع بي > صلاحية 95% من التجارة والنقل⁺ الخلايا بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية.
   2. استبعاد دوبليتس الخلية، وفقا لمعلمات نظام مراقبة الأصول الميدانية الجهاز قيد الاستخدام.
   3. ضمن أبواب اللمفاوية و/أو السلائف، تحديد العدد والنسبة المئوية للخلايا بروتينات فلورية خضراء⁺ .
3. استخدام فيكوريثرين (PE) وكثافة التجارة والنقل، وتعريف بوابة للتجارة والنقل^– مقابل بروتينات فلورية خضراء^لو مقابل بروتينات فلورية خضراء^مرحبا الخلايا.
   ملاحظة: يحمل الخلايا ب الفلورية بروتينات فلورية خضراء قاتمة وإظهار خلايا تي بروتينات فلورية خضراء مشرقة في خطوط lck:eGFP . تحتوي العديد من الأجهزة اللمفاوية أو عينات الورم كل السكان التجارة والنقل⁺ . ب-النسب هي خلايا/ب-جميع بروتينات فلورية خضراء^لو تي-النسب خلايا/تي-جميع وبروتينات فلورية خضراء^مرحبا. تعريف البوابات للتمييز بين التجارة والنقل^–والتجارة والنقل^{، لو}، والتجارة والنقل^مرحبا الخلايا، وجمع هؤلاء السكان بشكل منفصل (الشكل 2 أ-جو الشكل 3 ألف-ج، الشكل 4A و الشكل 5A).
4. فرز كل سكان الخلية إلى أنابيب البولي بروبلين مختلفة 15 مل يحتوي على 2 مل من فرز وسائل الإعلام أو مباشرة إلى أنابيب مختلفة 1.5 مل يحتوي على مخزن مؤقت مناسب لإجراء تحاليل إضافية (مثلاً، الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، أو استخراج البروتين، في زرع الو، إلخ.).
5. تبقى الخلايا المنقي على الجليد قبل مزيد من التحليلات.

النتائج

قمنا باستخدام التدفق الخلوي لتحليل ونظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل بروتينات فلورية خضراء^لو وبروتينات فلورية خضراء^مرحبا خلايا من الغدة الصعترية ونخاع الكلي والطحال من الزرد lck:eGFP المعدلة وراثيا. وكشف تحليل الأسماك عمره 3 أشهر الغدة الصعترية الوارد م?...

Discussion

نحن البلدان المتقدمة النمو ويوفر بروتوكول لعزل الخلايا ب من lck:eGFP المعدلة وراثيا الزرد، إضافة إلى نماذج أخرى ريريو دال- ب-النسب التسميات^3،4هذا. بعض الشيء المثير للدهشة، ذهبت دون أن يلاحظها أحد تحديد بروتينات فلورية خضراء^لو ب الخلايا في هذا ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030