Isolando a maligna e as células B não-maligna do lck:eGFP Zebrafish

Resumo

Zebrafish transgênicos lck:eGFP express GFP altamente em linfócitos T e têm sido usados para estudar o desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda. Esta linha pode ser usado para células de estudo B, que expressam lck em níveis inferiores. Este protocolo descreve a purificação das malignas e não-malignas de células B de lck:eGFP zebrafish.

Resumo

Peixe-zebra (Danio rerio) é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento de linfócitos. Como mamíferos, d. rerio possuem um sistema imune adaptativo que inclui linfócitos B e T. Estudos de zebrafish linfopoiese são difíceis porque os anticorpos reconhecendo d. rerio marcadores de superfície celular geralmente não estão disponíveis, complicando o isolamento e caracterização de populações de linfócitos diferentes, incluindo B-linhagem células. Linhas transgénicas com linhagem específicas fluoróforo expressão são frequentemente utilizadas para contornar esse desafio. A linha de transgênicos lck:eGFP tem sido usada para estudar o desenvolvimento de células T d. rerio e também tem sido utilizada para o modelo de desenvolvimento de células T e a leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Embora lck:eGFP peixe têm sido amplamente utilizados para analisar a linhagem T-, eles não foram usados para estudar as células B. Recentemente, descobrimos que muitos zebrafish B células também expressam lck, embora em níveis inferiores. Consequentemente, lck:eGFP B células da mesma forma expressam níveis baixos de GFP. Baseado nesta constatação, desenvolvemos um protocolo para purificar as células B-linhagem de lck:eGFP zebrafish, que relatamos aqui. Nosso método descreve como utilizar um classificador fluorescente-ativado da pilha (FACS) para purificar as células B de peixe lck:eGFP ou linhas relacionadas, tais como double-transgénicos, rag2:hMYC; lck:eGFP peixe. Nestas linhas, células B, as células B particularmente imaturas, GFP expresso em níveis baixos, mas detectáveis, permitindo que eles sejam distintos de células T, que expressam a GFP altamente. As células B podem ser isoladas da medula, timo, baço, sangue ou outros tecidos. Este protocolo fornece um novo método para purificar as células B d. rerio , permitindo estudos focados em temas como o desenvolvimento de células B e linfócitos B malignidades.

Introdução

Zebrafish oferecer atributos poderosos, como manipulability genética, alta fecundidade, translucidez óptico e desenvolvimento rápido que facilitam o desenvolvimento de vertebrados estudando usando abordagens genéticas. Estas vantagens, juntamente com os recursos compartilhados de teleósteos e mamíferos hematopoiese, fazem d. rerio ideal para análises in vivo da função linfopoiese e linfócitos, de sua aparência mais antiga em larvas em toda a idade adulta. Desenvolvimento de sangue no zebrafish assenta bem conservados processos genéticos que são compartilhados com mamíferos, e estes se prolongam para o sistema imune adaptativo. Além disso, os mecanismos moleculares que regem o desenvolvimento linfoide são notavelmente conservados entre zebrafish e mamíferos¹.

Nas últimas 2 décadas, transgénicos d. rerio linhas que linhagens de sangue específico de rótulo e linhas mutantes deficientes nestas linhagens foram criadas^2,3,4,5. Um destes, a lck:eGFP linha de transgénicos, usa o promotor zebrafish linfócito proteína tirosina quinase (lck) para direcionar a GFP expressão⁶. Este gene, que é altamente expressa por ambos precursores de T-linhagem e linfócitos T maduros, permite em vivo, monitoramento do desenvolvimento do timo de células T e ex vivo da purificação de células T-linhagem por FACS⁷. Anteriormente, usamos esta linha em uma tela de mutagénese ENU para diante-genética para identificar germline mutantes propensos a T-ALL e estudar adquiridas somaticamente genéticos eventos ligados à célula T mixomas^8,9.

Recentemente, nosso laboratório alargado a utilidade do lck:eGFP zebrafish. Em duplo-transgênicos rag2:hMYC (MYC humana), lck:eGFP D. rerio que são conhecidos por desenvolver T-tudo ¹⁰, descobrimos que B-linhagem todos também ocorrem¹¹. Ao contrário de T-tudo neste modelo, que fluorescem brilhantemente devido a alta expressão de GFP, B-ALL são palidamente fluorescentes devido aos baixos níveis GFP, permitindo peixe com B-tudo a ser distinguida grosseiramente aqueles com T-ALL por microscopia fluorescente. Esta expressão diferencial de GFP também permite a separação de GFP^Eis B-todas as células de GFP^Oi células T-ALL usando FACS¹¹. Além disso, baixa lck expressão não é exclusivo do zebrafish B-ALL, como humanos B-ALL também expressam os baixos níveis de LCK^11,12. Da mesma forma, as células normais de B-linhagem de d. rerio, camundongos e humanos também expressam níveis baixos de lck/Lck/LCK, com as células B imaturas, tendo a mais alta expressão^11,13. Em uma base por célula, as células B-linhagem em linhas de zebrafish ou derivado de lckeGFP expressam 1-10% tanto GFP como linfócitos T. Estes GFP^Eis células expressa característica mRNAs de células B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze outros e podem ser purificado a partir da medula, timo, baço ou periférico sangue,¹¹. Portanto, ambos linhagem B - e T-células podem ser isolado de lckeGFP zebrafish e no caso de rag2hMYC, lckeGFP animais, células B e T-tudo bem como¹¹.

Aqui, apresentamos nosso protocolo para eficientemente FACS-purificar não-malignas células B de lck:eGFP zebrafish e não-malignas ou malignas de células B de rag2hMYC; lck:eGFP peixe, usando vários tecidos de origem. Tais células da mesma forma podem ser quantificadas por citometria de fluxo, sem isolamento de FACS, se desejado. Descoberta de baixo lck expressão- e consequentemente, baixa expressão de GFP-por B células abre novas portas de possibilidades experimentais para lckeGFP zebrafish, tais como estudos do desenvolvimento de células vivo em B. Assim, esta linha de transgénica, relatada pela primeira vez em 2004, tem vida nova como buscamos para utilizá-lo para recolher ideias frescas relativa imunidade adaptativa zebrafish.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo zebrafish foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) no centro de Ciências da saúde Universidade de Oklahoma.

1. isolando B não-malignas e linfócitos T do transgênico lck:eGFP peixe

1. Anestesia o peixe usando metanosulfonato de 0,02% (MS-222) no sistema de água de peixes.
2. Examine o peixe de 2-6 meses de idade para thymi fluorescente, que estão localizados no aspecto dorsomedial da cavidade branquial de zebrafish e outros teleósteos¹⁴. Use um microscópio de epifluorescência (470/40 de comprimento de onda de excitação e emissão de 525/50 filtro) para detectar as boas práticas agrícolas.
3. Prepare com antecedência 50 mL de filtro-esterilizados 1 x Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) contendo 1% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina (classificação de mídia). Mídia de classificação não utilizadas pode ser armazenadas a 4 ° C por até 2 meses.
4. Eutanásia o peixe, colocando-o em um béquer contendo 0,2% tricaina por aproximadamente 5 min, seguido por imersão de banho de gelo. Confirme morte com a cessação do movimento de odontódios (peixe).
5. Coloque o peixe euthanized em uma placa de Petri e dissecar órgãos linfoides de interesse, usando o microscópio fluorescente para dissecar o GFP⁺ thymi¹⁴e configurações de microscopia de campo claro para dissecar o rim para a medula e o baço¹⁵. Os resultados aqui apresentados foram obtidos usando a 3 meses de peixes. Proporções de linfócitos e números absolutos variam de acordo com a idade e genótipo (veja a discussão para mais detalhes).
6. Coloque cada órgão dissecado em um tubo de 1,5 mL contendo 500 µ l de frio a classificação de meios de comunicação.
7. Homogeneizar o tecido no gelo usando um homogeneizador de microtubo de pilão.
8. Passe o tecido homogeneizado através de um filtro de malha de 35 µm para gerar uma suspensão de célula única. Manter as células no gelo até análise.

2. isolar linfócitos malignos de duplo-transgênicos rag2:hMYC; lck:eGFP Zebrafish

1. Começando em 2-4 meses, microscopicamente a tela rag2:hMYC; lck:eGFP peixe por padrões anormais de GFP.
   Nota: as células B são GFP^Eis no fundo lck:eGFP , B-ALL requer prática para reconhecer; T-tudo é óbvio, porque as células T são GFP^Oi. Consequentemente, a rag2:hMYC, lck:eGFP linha dual-transgênicos tem dois fenótipos: brilhantemente-fluorescente T-ALL, que geralmente surgem a partir do Timo e estender para o corpo e palidamente fluorescente B-ALL.
   1. Usando um microscópio fluorescente, tela o peixe usando as configurações de "baixa exposição" (200 ms, ganho x 2,4) para identificar brilhante T-ALL (figura 1A) e "alta exposição" (1,5 s, ganho x 3,4) para identificar dim B-ALL (figura 1A). Controles WT e pre-leucêmicas peixes têm GFP localizada apenas no timo (figura 1B).
2. Anestesia e examinar o peixe como descrito nos passos 1.1-1.2.
3. Categorize os peixes baseados-se na medida da fluorescência de GFP, usando um simples sistema de categoria de três:
   Nota: Nível 1: Fluorescência aparece como um tumor do Timo com apenas limitada difusão local.
   Nível 2: Fluorescência aparece além do timo, envolvendo < 50% do corpo.
   Nível 3: Fluorescência ultrapassa 50% do corpo.
4. Separe o peixe com todos do que aqueles sem câncer. Monitore pre-leucêmicas peixe (ou seja, sem tumores GFP⁺ ) uma vez mensal para o desenvolvimento do novo tudo. Por ~ 9 meses, todos os rag2:hMYC, lck:eGFP peixe desenvolve T-ALL, B-ALL, ou ambos.
5. Para isolamento de células B ou T --todos, selecione o peixes de nível 3 (todos envolvendo > 50% do corpo), que rende mais de 2 x 10⁶ todas as células e geralmente muitos mais.
6. Eutanásia o peixe como na etapa 1.4.
   Nota: Existem dois métodos para obter todas as células: corpo inteiro homogeneização e uma técnica de lavagem peritoneal¹⁶. Os métodos diferem no número absoluto de células coletadas para classificação, e assim, os montantes de FACS tempo necessário e custo (veja a discussão para mais detalhes).
7. Para qualquer método, primeiro coloque o peixe euthanized em uma placa de Petri e usando uma lâmina de barbear, retire a cabeça, incluindo a região do timo. Isto pode ser processado separadamente, se desejado, ou usado para coloração histológica.
8. Método de lavagem peritoneal
   1. Usando uma pipeta P1000, lave a cavidade peritoneal de peixe com 500 µ l de frio classificação mídia, coletando as células e a mídia em um tubo de 5 mL.
   2. Utilize uma ponta de pipeta fresco, injete um μl 200 – 300 adicionais de classificação criogênicos na cavidade do corpo. Em seguida, usando a ponta da pipeta, aplique uma pressão suave para o corpo do peixe para expulsar as células fora da cavidade do corpo. Recolher esta mídia e adicionar ao tubo de 5 mL.
   3. Repita a etapa 2.8.2 2 – 3 vezes. Manter as células coletadas na classificação de mídia no gelo.
   4. Filtre a suspensão de células, apesar de uma malha de 35 µm filtro antes da citometria de fluxo/FACS e manter as células no gelo até análise.
9. Homogeneização de corpo inteiro
   1. Depois de retirar a cabeça do peixe, coloca o corpo em um tubo de 1,5 mL contendo 200 µ l de classificação de meios de comunicação.
   2. Homogeneizar o corpo usando um homogeneizador de microtubo de pilão.
   3. Adicione um adicionais 300 μL de frio a classificação de meios de comunicação. Filtre a suspensão de células, apesar de um filtro de malha de 35 µm. Adicione mídia classificação conforme necessário para lavar todas as células através do filtro, até que apenas os restos de tecido permanecem no filtro. Manter as células no gelo até análise.

3. Cytometric Analysis dos linfócitos B Normal ou maligno

1. Conjunto de análise de fluxo cytometric e/ou parâmetros de FACS, de acordo com o guia do fabricante.
2. Adquira o número desejado de eventos inicialmente caracterizar a amostra. Analise a 1 x 10⁴ a 5 x 10⁴ eventos antes da classificação para determinar a portas específicas para as etapas subsequentes de classificação.
   1. Determinar os portões: definir linfócitos e progenitoras portões de célula usando forward scatter (FSC) e parâmetros de dispersão (CCD) de lado, excluindo os restos celulares (Fig. 2A-C)¹⁷. FSC e CCD correspondem a célula tamanho/diâmetro e granularidade, respectivamente.
      Nota: GFP^–, GFP^Eise GFP^Oi células diferem 10-para-100-fold em termos de sua intensidade de fluorescência de GFP, tornando a separação destas populações simples (figuras 2-5). Discriminação de morto-vivo pode ser avaliada neste ponto usando iodo propidium (PI) ou 7-aminoactinomycin D (7-Agostinho) viabilidade coloração. Experiências anteriores com PI geralmente demonstram > 95% de viabilidade de células GFP⁺ após FACS.
   2. Exclua as parelhas de célula, de acordo com os parâmetros da máquina FACS sendo usado.
   3. Dentro dos portões linfoides e/ou precursor, determine o número e a percentagem de células GFP⁺ .
3. Use ficoeritrina (PE) e intensidades GFP, definir portão de GFP^– vs GFP^Eis vs^Oi células GFP.
   Nota: As células B apresentam fluorescência ofuscante de GFP e células T mostram GFP brilhante nas linhas de lck:eGFP . Muitos órgãos linfoides ou tumor amostras contêm ambas as populações GFP⁺ . B-linhagem células/B-todos são GFP^Eis e T-linhagem de células/T-ALL são GFP^Oi. Definir portas para distinguir entre GFP^–, GFP^Eise^Oi células GFP e coletar estas populações separadamente (Fig. 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A e Figura 5a).
4. Classificar cada população de células em tubos de polipropileno de diferentes 15 mL contendo 2 mL de classificação de meios de comunicação, ou diretamente em tubos de diferentes 1,5 mL, contendo um amortecedor apropriado para análises mais adicionais (por exemplo, RNA, DNA ou extração da proteína, allo-transplante, etc.).
5. Manter células purificadas no gelo antes de novas análises.

Resultados

Nós usamos a citometria de fluxo para analisar e FACS para isolar a GFP^Eis e GFP^Oi células do timo, medula renal e baço de lck:eGFP zebrafish transgênicos. Análise de peixe 3 meses revelou que o Timo contida principalmente os linfócitos GFP⁺ . Células GFP⁺ em grande parte estavam confinadas ao portão linfoide anteriormente descrito pelo Traver et al.¹⁷. Duas populações distintas de GFP⁺ , GFP...

Discussão

Desenvolvemos e fornecer um protocolo para isolar as células B de lck:eGFP zebrafish transgênicos, adicionando isso para outros modelos de d. rerio com B-linhagem rótulos^3,4. Surpreendentemente, a identificação de GFP^Eis B células nesta linha passou despercebida desde sua descrição em 2004. Geralmente, lck é considerado de células T específicas⁶, mas os estudos recentes encontraram expressã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030