从 lck 中分离恶性和非恶性 b 细胞: egfp斑马鱼

摘要

转基因lck: egfp斑马鱼在 t 淋巴细胞中表达 gfp 的高度, 并已被用于研究 t 细胞发育和急性淋巴细胞白血病。这条线可以用来研究 b 细胞, b 细胞在较低的水平上表达lck 。该协议描述了从lck: egfp斑马鱼的恶性和非恶性 b 细胞的纯化。

摘要

斑马鱼 (daio rerio)是研究淋巴细胞发育的一个强有力的模型。像哺乳动物一样, d. rerio拥有包括 b 和 t 淋巴细胞在内的适应性免疫系统。斑马鱼淋巴生成的研究是困难的, 因为抗体识别d. rerio 细胞表面标记物一般是不可用的, 使分离和表征不同的淋巴细胞群, 包括 b 系细胞。具有血统特异性荧光体表达的转基因线经常被用来规避这一挑战。转基因lck:egfp系已被用于研究d. rerio t 细胞的发育, 也被用于模型 t 细胞发育和急性淋巴细胞白血病 (t-all)。虽然lck:egfp鱼被广泛用于分析 t 系, 但它们还没有被用来研究 b 细胞。最近, 我们发现, 许多斑马鱼 b 细胞也表达了 lck, 尽管水平较低。因此, lck:egfp b 细胞同样表达低 gfp 水平。基于这一发现, 我们开发了一个从lck: egfp斑马鱼净化 b 系细胞的协议, 我们在这里报告。我们的方法描述了如何利用荧光激活细胞分选器 (facs) 从lck: egfp鱼或相关的线, 如双转基因的 ragycb 细胞纯化;egfp 鱼。在这些细胞中, b 细胞, 特别是不成熟的 b 细胞, 在较低但可检测的水平上表达 gfp, 使它们能够与 t 细胞区分开来, 从而高度表达 gfp。b 细胞可以从骨髓、胸腺、脾脏、血液或其他组织中分离出来。该方案提供了一种净化d. rerio b 细胞的新方法, 使研究的重点是 b 细胞发育和 b 淋巴细胞恶性肿瘤等主题。

引言

斑马鱼具有强大的特性, 如遗传操纵能力、高繁殖力、光学半透明和快速发育, 有助于利用遗传方法研究脊椎动物的发育。这些优势, 再加上远端和哺乳动物造血的共同特征, 使d. rerio 成为在体内分析淋巴细胞和淋巴细胞功能的理想选择, 从它们在整个成年期间在幼虫中的最早出现。斑马鱼的血液发育依赖于与哺乳动物共享的保存良好的遗传过程, 这些过程延伸到适应性免疫系统。此外, 斑马鱼和哺乳动物之间的分子机制在淋巴发育方面得到了显著的保护。

在过去的20年里, 在这些血统中缺乏的特定血液谱系和突变系的转基因d. rerio 系已经被创造出来 2^,3,4,5。其中, lck: egfp转基因线, 利用斑马鱼淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶 (lck) 启动子来驱动 gfp 表达 6.该基因由 t 系前体和成熟的 t 淋巴细胞高度表达, 可通过流式细胞仪7在体内跟踪胸腺 t 细胞的发育和 t 系细胞的体外纯化.以前, 我们在前瞻性遗传 enu 突变屏幕中使用这条线来识别容易发生 t-all 的种系突变体, 并研究与 t 细胞肿瘤发生 8^,9有关的体细胞获得的基因事件。

最近, 我们的实验室进一步扩大了lck 的效用: egfp斑马鱼。在双转基因的 rmyc (人 myc), lck:egfp d. rerio,已知开发 t-all ^10,我们发现 b-血统 all 也发生¹¹。与 t-all 在这个模型中不同的是, 由于 gfp 表达较高, t-all 荧光明亮, 由于 gfp 水平较低, 允许 b-all 的鱼与使用荧光显微镜的鱼区别开来。这种差异 gfp 表达还允许使用流式细胞管制11将 gfp lo b-all 细胞与 gfp^hit-all 细胞分离.此外, 低lck表达并不是斑马鱼 b-all 所独有的, 因为人类 b-all 也表达低lck^11,12。同样, d. rerio、小鼠和人类的正常 b 系细胞表达的 lck/lck/lck 水平也很低, 不成熟的 b 细胞的表达最高11^,13. 在每个细胞的基础上, b-沿袭细胞在lckegfp zzbrafish 或衍生物线表示1-10 尽可能多的 gfp t 淋巴细胞。这些 gfp^lo细胞表达典型的 b 细胞 mrna, 如pax5、 cd79b、 blnk、btk、 ighm、 ighm等, 可以从骨髓、胸腺、脾脏或外周中纯化血¹¹。因此, b-和 t 系细胞都可以从lckegfp zebrafish 中分离, 在rag2hMYC、 lckegfp动物、b-和 t-all 细胞的情况下, 也可以^分离出11。

在这里, 我们提出了我们的方案, 以有效地 facs 纯化非恶性 b 细胞从 lck: egfp斑马鱼, 和非恶性或恶性 b 细胞的 rag2hMYC; egfp鱼, 使用各种来源组织。如果需要, 这种细胞同样可以通过流式细胞术量化, 而无需流式细胞仪分离。低lck表达的发现--因此, 低 gfp 表达 b 细胞为lckegfp zzbrafish 的实验可能性打开了新的大门, 例如体内b 细胞的发育研究。因此, 这条在2004年首次报道的转基因线, 有了新的生命, 因为我们试图利用它来收集关于斑马鱼适应性免疫的新见解。

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研究方案

所有涉及斑马鱼的程序都得到了俄克拉荷马大学健康科学中心动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 从转基因 lck 中分离非恶性 b 和 t 淋巴细胞: egfp 鱼

1. 在鱼系水中使用0.02% 的滴虫 (ms-222) 对鱼类进行麻醉。
2. 检查2-6个月大的鱼荧光胸腺, 这是位于斑马鱼和其他心灵的分枝腔的背侧, 14.使用荧光显微镜 (470/40 激发波长和 2525-50 发射滤波器) 检测 gfp。
3. 事先准备50毫升的过滤消毒1x 罗斯威尔公园纪念研究所媒体 (rpmi) 含有1% 的胎牛血清和1% 的青霉素链霉素 (分选介质)。未使用的分类介质可在4°c 下存储长达2个月。
4. 将鱼放入含有0.2% 的三胺的烧杯中, 使其浸渍约 5分钟, 然后浸泡冰浴。通过停止手术 (刺) 运动来确认死亡。
5. 将安乐死的鱼放入培养皿中, 解剖感兴趣的淋巴器官, 使用荧光显微镜解剖 gfp⁺胸腺¹⁴, 并在明亮的现场显微镜设置中解剖肾骨髓和脾脏¹⁵。这里介绍的结果是使用3个月大的鱼。淋巴细胞比例和绝对数字因年龄和基因型而异 (详见讨论)。
6. 将每个解剖器官放置在含有500μl 冷分选介质的 1.5 ml 管中。
7. 使用微管均质机对冰上的组织进行均质化。
8. 通过35μm 网格过滤器通过均质组织, 生成单个细胞悬浮液。将细胞放在冰上, 直到分析。

2. 从双基因 rag2:hMYC;lck:eGFP 斑马鱼中分离恶性淋巴细胞

1. 从2-4 开始, 显微镜下筛选rag2: hmyc;用于异常 gfp模式的 egfp 鱼。
   注: b 细胞是 gfp lo 在 lck: egfp背景, 所以 b-all 需要实践识别;t-all 是显而易见的, 因为 t 细胞是 gfp^喜.因此, rag2: hmyc, lck:egfp双基因线有两种表型: 明亮荧光 t-all, 通常产生于胸腺并延伸到体内, 和昏暗荧光 b-all。
   1. 使用荧光显微镜, 使用 "低曝光" 设置 (200 毫秒, 2.4 x 增益) 筛选鱼, 以识别明亮的 t-all (图 1a) 和 "高曝光" (1.5 s, 3.4 x 增益), 以识别暗淡的 b-all (图 1 a)。wt 控制和白血病前鱼类仅在胸腺中定位 gfp (图 1b)。
2. 按照步骤1.1–1.2 中的说明对鱼类进行麻醉和检查。
3. 使用简单的三个类别系统, 根据 gfp 荧光的范围对鱼类进行分类:
   请注意:第1级: 荧光表现为胸腺肿瘤, 局部扩散有限。
   第2级: 荧光出现在胸腺之外, 涉及 lt;50 的身体。
   第3级: 荧光延伸到身体的50% 以上。
4. 把鱼和 all 和没有癌症的鱼分开。每月一次监测白血病前鱼类 (即没有 gfp⁺肿瘤的鱼), 用于新的 all 的发展。~ 9个月后, 所有的 rag2: hmyc, lck: egfp鱼开发 t-all, b-all, 或两者兼而有之。
5. 对于 t-或 b-all 细胞隔离, 选择3级鱼 (all 占身体的 gt;50%), 它产生超过 2 x^{10 6 all 细胞}, 通常会产生更多细胞。
6. 按照步骤1.4 中的步骤1.4 对鱼进行安乐死。
   请注意:获得所有细胞的方法有两种: 全身同质化和腹膜清洗技术¹⁶。这些方法在收集用于排序的单元格的绝对数量上有所不同, 因此, 在流式细胞系统所需的时间和成本方面也有所不同 (有关详细信息, 请参阅讨论)。
7. 无论哪种方法, 首先将安乐死的鱼放在培养皿中, 并使用剃须刀片, 取出头部, 包括胸腺区域。如果需要, 可以单独处理, 也可以用于组织学染色。
8. 腹膜清洗方法
   1. 使用 p1000 移液器, 用500μl 的冷分选介质清洗鱼腹膜腔, 在5毫升管中收集细胞和培养基。
   2. 使用新鲜的移液器尖端, 再向体腔中注入200–300μl 的冷分选介质。然后, 使用移液器的尖端, 对鱼体施加温和的压力, 将细胞挤出体腔。收集此介质并添加到 5 ml 管。
   3. 重复步骤 2.8.2 2-3 次。将收集的单元格保存在冰上的培养基中。
   4. 在流式细胞仪/流式细胞仪之前, 通过35μm 网状过滤器对细胞悬浮液进行过滤, 并将细胞保持在冰上, 直到进行分析。
9. 全身同质化
   1. 取下鱼头后, 将阀体放入含有200μl 分选介质的 1.5 ml 管中。
   2. 使用双管均质机对人体进行均质化。
   3. 添加额外的300μl 冷分选介质。通过35μm 网格过滤器对细胞悬架进行过滤。根据需要添加分拣介质, 通过过滤器清洗所有细胞, 直到滤清器上只保留组织碎片。将细胞放在冰上, 直到分析。

3. 正常或恶性 b 淋巴细胞的细胞学分析

1. 根据制造商的指导, 设置流式细胞仪分析和流式细胞仪参数。
2. 获取所需数量的事件, 以初步描述样本的特征。在排序之前分析 1 x 10 4 到 5 x¹⁰ 4 事件, 以确定后续分选步骤的特定门。
   1. 确定门: 使用向前散射 (fsc) 和侧向散射 (ssc) 参数 (不包括细胞碎片) 17 定义淋巴细胞和祖细胞门.fsc 和 ssc 分别对应于细胞大小直径和粒度。
      请注意:gfp^-、gfp^lo和 gfp^喜细胞在 gfp 荧光强度方面相差10到 100倍, 使这些人群的分离变得简单 (图 2-5)。此时可使用丙酸碘 (pi) 或 7-氨基放线菌素 d (7-aaad) 染色的可行性来评估活死歧视。先前的 pi 实验通常显示和 gt;95 的能力的 gfp + 细胞后 facs^.
   2. 根据所使用的流式细胞仪机的参数排除单元双头。
   3. 在淋巴和/或前驱门内, 确定 gfp⁺细胞的数量和百分比。
3. 使用植物菊酯 (pe) 和 gfp 强度, 定义 gfp 与 gfp 与 gfp与 gfp^hi细胞的门.
   请注意:b 细胞表现出暗淡的 gfp 荧光, t 细胞在lck: egfp线中表现出明亮的 gfp。许多淋巴器官或肿瘤样本同时包含 gfp⁺群体。b 系细胞/-all 是 gfp^lo和 t-沿袭细胞/all 是 gfp^hi。定义用于区分 gfp^-、gfp^lo和 gfp^hi细胞的门, 并分别收集这些群体 (图 2a-c,图3a-c,图 4 a和图5a)。
4. 将每个细胞群分为含有2毫升分选介质的不同15毫升聚丙烯管, 或直接放入含有适当缓冲液的不同 1.5 ml 管中进行进一步分析 (例如, rna、dna 或蛋白质提取、同种异体移植等)。
5. 在进一步分析之前, 将纯化的细胞保存在冰上。

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结果

我们采用流式细胞仪分析和流式细胞仪分离胸腺、肾骨髓和脾脏的 gfp lo 和 gfp^{hi 细胞} : egfp转基因斑马鱼。对3个月大的鱼类的分析显示, 胸腺主要含有 gfp⁺淋巴细胞。gfp⁺细胞主要局限于 traver 等人先前描述的淋巴门.在胸腺中可以观察到两个不同的gfp + 种群, gfp^lo和 gfp^hi.gfp^hi淋?...

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讨论

我们开发并提供了一种从 lck 中分离 b 细胞的协议: egfp转基因斑马鱼, 并将其添加到其他带有 b 系标签 3^,4的 d . rerio 模型^中。有些令人惊讶的是, 自2004年描述以来, 这一行中 gfp^lo b 细胞的识别没有引起注意。一般来说, lck被认为是 t 细胞特有的6, 但最近的研究发现, 自然杀手和骨髓细胞, 以及 b 细胞中的意外 lc...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030