Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

요약

유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.

초록

Zebrafish (Danio rerio)는 림프 구 개발을 공부 하는 강력한 모델입니다. 포유류 처럼, D. rerio B와 T 림프 톨을 포함 하는 적합 한 면역 계통을 소유. D. rerio 세포 표면 마커를 인식 하는 항 체는 일반적으로 분리 및 B 계보를 포함 하 여 다른 림프 구 인구의 특성을 복잡 하 게 사용할 수 없습니다 때문에 제 브라 lymphopoiesis의 연구는 어려운 셀입니다. 계보 특정 fluorophore 식 유전자 변형 라인 자주이 문제를 우회 하는 데 사용 됩니다. 유전자 변형 lck:eGFP 라인 D. rerio T 셀 개발, 연구 하는 데 사용 되었습니다 그리고 또한 모델 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병 (T-모든) 활용 되었습니다. Lck:eGFP 물고기 널리 사용 되었습니다 T-계보를 분석, 하지만 그들은 하지 B 세포 연구에 사용 되었습니다. 최근, 우리가 발견 lck을 표현 하는 많은 zebrafish B 셀 낮은 수준에 쓰 신. 따라서, lck:eGFP B 세포는 마찬가지로 GFP의 저급을 표현 한다. 이에 따라, 우리 lck:eGFP zebrafish, 우리가 보고 여기에서 B 계보 세포를 정화 하는 프로토콜을 개발 했다. 우리의 방법은 정화 lck:eGFP 물고기 또는 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; 등 관련된 라인에서 B 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 활용 하는 방법을 설명 합니다. lck:eGFP 물고기입니다. 에이 라인, B 세포, 특히 미 성숙한 B 세포, 낮은 하지만 감지 수준 급행 GFP 그들 고유 높은 GFP를 표현 하는 T 세포에서 허용. B 세포는 골 수, 흉 선, 비장, 혈액, 또는 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 정화 D. rerio B 세포, B 세포 개발 및 B 림프 구 악성 같은 주제에 초점을 맞춘 연구를 활성화 하는 새로운 방법을 제공 합니다.

서문

Zebrafish는 강력한 특성, 유전자 manipulability, 높은 통치, 광학 반투명, 급속 한 발전 등 유전자 방법을 사용 하 여 공부 척추 개발을 용이 하 게 제공 합니다. Teleost 및 포유류 조의 공유 기능과 함께 이러한 장점을 D. rerio 애벌레 성인 기 동안에 그들의 가장 이른 외관에서 lymphopoiesis 및 림프 구 기능 vivo에서 분석에 적합 확인합니다. Zebrafish에 혈액 개발, 포유류와 공유 하는 잘 보존 유전 프로세스에 의존 하 고 이러한 적응형 면역 체계에 확장. 또한, 림프 개발을 경 세 하는 분자 메커니즘은 너무나 zebrafish 및 포유류¹사이 보존 하 고.

지난 2 년간 유전자 변형 D. rerio 라인 그 레이블 특정 혈액 계보 그리고 돌연변이 라인 결핍이 계보에 생성 된^2,3,,45. 이 lck:eGFP 유전자 변형 라인 중 하나 GFP 식⁶드라이브 zebrafish 림프 구 단백질 티로신 키 니 아 제 (lck) 발기인을 사용 하 여. 높은 T-혈통 선구자와 성숙한 T 세포에 의해 표현,이 유전자 vivo FACS⁷thymic T 세포 개발의 및 T-계보 세포의 생체 내 정화 전 추적에서 있습니다. 이전에 우리 사용이 줄 앞으로 유전 ENU mutagenesis 화면에 T-모든 경향이 생식 돌연변이 식별 하 고 somatically 인수 유전자 T 셀 발암^8,9에 연결 된 이벤트를 공부 하.

최근, 우리 연구소는 더 lck:eGFP zebrafish의 유틸리티 확장. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC (인간 MYC), T-모든 ¹⁰, 개발 된 lck:eGFP D. rerio 에서 우리가 발견 B 계보도¹¹를 발생 하는 모든. T-모든 높은 GFP 식 인해 밝은 형광,이 모델에서와 달리 B-모든은 어렴풋이 형광 수준 때문에 낮은 GFP, B-모든 구별 될 조잡 한 그 T-모든 형광 현미경 검사 법에 의해를 가진 물고기를 수 있도록. 이 차동 GFP 식 또한 허용 GFP로 B-모든 세포의 분리에서 GFP^{안녕하세요} FACS¹¹를 사용 하 여 T-모든 셀. 또한, 낮은 lck 식 고유 하지 않습니다 제 B-전체, 브라를 LCK^11,12의 인간의 B-모든 익스프레스 또한 낮은 수준으로. 마찬가지로, D. rerio, 쥐, 및 인간의 정상적인 B 계보 세포는 또한 lck의 저급을 표현 /LckLCK, 미 성숙한 B 세포와 데 높은 식^11,13. 셀 당 기준 lckeGFP zebrafish 또는 파생 라인에 B 계보 세포 표현 1-10% 만큼 GFP T 림프 톨으로. 이러한 GFP^로 표현 특성 등 pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, B 세포 mRNAs 세포와 골 수, 흉 선, 비장, 또는 주변에서 순화 될 수 있다 피¹¹. 따라서, 둘 다 B-및 T-계보 세포 수 격리 lckeGFP zebrafish, 그리고 rag2hMYC, lckeGFP 동물, 뿐만 아니라 B 및 T 모든 셀의 경우¹¹.

여기, 우리가 현재 우리의 프로토콜 효율적으로 FACS 정화 비 악성 B 세포에 lck:eGFP zebrafish, 및 rag2hMYC;의 비 악성 또는 악성 B 세포에서 lck:eGFP 물고기, 다양 한 소스 티슈를 사용 하 여. 원하는 경우 이러한 셀 마찬가지로 FACS 격리 없이 cytometry에 의해 측정할 수 수 있습니다. 낮은 lck 식의 발견-GFP 식 결과, 낮은-b 셀 비보 B 세포 발달 연구와 같은 lckeGFP zebrafish에 대 한 실험 가능성의 새로운 문의 엽니다. 따라서, 2004 년에 처음 보고 된이 유전자 변형 라인 우리가 추구 zebrafish 적응 면역에 관한 신선한 통찰력을 수집에 그것을 활용 새로운 생명이 있다.

프로토콜

제 브라와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 오클라호마 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 되었다.

1. 유전자 변형 lck:eGFP 생선 에서 비 악성 B 및 T 림프 구 분리

1. 물고기 물고기 시스템 물에 0.02 %tricaine (MS-222)를 사용 하 여 anesthetize
2. 제 브라와 다른 teleosts¹⁴의 아가미 구멍의 dorsomedial 측면에 있는 형광 thymi에 대 한 2-6 달 오래 된 물고기를 검사 합니다. (470/40 여기 파장과 525/50 방출 필터) GFP를 감지 하는 epifluorescence 현미경을 사용 합니다.
3. 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 포함 1% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 (정렬 미디어) x 필터 살 균 1의 50 mL를 사전에 준비 합니다. 사용 하지 않는 정렬 미디어 4 ° C에서 최대 2 개월까지 저장할 수 있습니다.
4. 0.2% 들어 있는 비 커에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사 약 5 분, Tricaine 뒤에 얼음 목욕 침수. Opercular (길) 움직임의 정지에 의해 죽음을 확인 합니다.
5. 안락사 물고기를 페 트리 접시에 놓고 GFP⁺ thymi¹⁴, 그리고 밝은 분야 현미경 검사 법 설정을 신장 골 수, 비장¹⁵를 해 부 해 부에 형광 현미경을 사용 하 여 관심사의 림프 기관 해 부 합니다. 여기에 제시 된 결과 3 개월 된 물고기를 사용 하 여 얻은 했다. 림프 구 비율과 절대 수 나이 및 유전자 형 (추가 세부 사항에 대 한 토론 참조) 마다 다릅니다.
6. 각의 해 부 기관 미디어 정렬 감기 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배치 합니다.
7. 유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 얼음에 조직 균질
8. 무 균된 조직 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 35 µ m 메쉬 필터를 통해 전달 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.

2. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; lck:eGFP 제 브라 에서 악성 세포 분리

1. 2-4 개월에 시작에 불과합니다, 미세 스크린 rag2:hMYC; 비정상적인 GFP 패턴에 대 한 lck:eGFP 물고기.
   참고: B 세포는 GFP^lo lck:eGFP 배경에서 그래서 B-모든 필요 인식; 연습 T-모든 때문에, T 세포는 GFP^{안녕하세요}. 결과적으로는 rag2:hMYC, lck:eGFP 듀얼-유전자 변형 라인은 두 개의 고기: 밝은 형광 T-모두, 일반적으로 thymus에서 발생 하 고 몸과 어렴풋이 형광 B-모든으로 확장.
   1. 형광 현미경을 사용 하 여 화면 (200 ms, 2.4 x 이득) 밝은 T-모든 (그림 1A) 및 "높은 노출" 파악 "낮은 노출" 설정을 사용 하 여 물고기 (1.5 s, 3.4 x 이득) dim B-모든 (그림 1A)를 식별. WT 컨트롤 및 사전 leukemic 물고기 GFP thymus (그림 1B)에 있다.
2. Anesthetize 고 1.1-1.2 단계에서 설명한 대로 물고기를 검사 하십시오.
3. 간단한 3 카테고리 시스템을 사용 하 여 GFP 형광의 정도에 따라 생선을 분류:
   참고: 레벨 1: 형광만 제한 지역 확산 thymic 종양으로 나타납니다.
   레벨 2: thymus, 관련 된 넘어 형광 표시 < 신체의 50%.
   레벨 3: 형광 신체의 50% 넘어 확장 됩니다.
4. 암 없는 그 모든 물고기를 구분 합니다. 모니터링 미리 leukemic 물고기 (GFP⁺ 종양 즉, 생선) 한 번 매달의 새로운 개발에 대 한. ~ 9 개월, 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기 개발 T-모든, B-전체, 또는 둘 다.
5. T 또는 B 모든 세포 격리를 위한 선택 레벨 3 물고기 (모든 관련 > 본문의 50%)는 항복 2 x 10 이상⁶ 셀을 모두, 그리고 더 일반적으로 많은.
6. 1.4 단계 에서처럼 물고기 안락사
   참고: 모든 세포를 얻기 위해 두 가지 방법이 있다: 균질 및 복 막 세척 기술¹⁶몸 전체. 따라서, FACS 양의 시간이 필요 하 고 비용과 방법 셀 정렬, 수집된의 절대 수에 다 (더 자세한 내용 참조).
7. 두 메서드 중 하나에 대 한 먼저 안락사 물고기 페 트리 접시에 놓고 thymic 지역을 포함 한 머리 제거 면도칼 블레이드를 사용 하 여. 이 수는 별도로 처리, 원하는, 또는 조직학 얼룩에 사용 하는 경우.
8. 복 막 세척 방법
   1. P1000 피 펫을 사용 하 여 씻어 감기 미디어, 세포와 미디어 5 mL 튜브에 수집을 정렬의 500 µ L로 생선 복 막 구멍.
   2. 신선한 피 펫 팁을 사용 하 여, 신체 구멍으로 차가운 정렬 미디어의 추가 200-300 µ L를 주사. 다음, 신체 구멍에서 세포를 돌출 시킬 물고기 몸에 부드러운 압력을 적용는 피 펫의 끝을 사용 하 여. 이 미디어를 수집 하 고 5 mL 튜브에 추가.
   3. 2.8.2 단계 2-3 회 반복 합니다. 얼음에 미디어를 정렬에 수집 된 셀을 계속.
   4. 35 µ m 메쉬 흐름 cytometry/FACS 전에 필터링 하 고 분석까지 얼음에 셀을 계속 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
9. 몸 전체 균질
   1. 생선 머리를 제거 후 미디어 정렬의 200 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 시체를 놓습니다.
   2. 유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 본문 균질
   3. 감기 미디어 정렬의 추가 300 µ L를 추가 합니다. 하지만 35 µ m 메쉬 필터 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 필터에 조직 파편만 남아 때까지 필터를 통해 모든 셀을 세척 하는 데 필요한 정렬 미디어를 추가 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.

3. Cytometric 분석 정상 또는 악성 B 세포의

1. 흐름 cytometric 분석 및/또는 제조 업체의 설명서에 따라 FACS 매개 변수를 설정 합니다.
2. 처음 샘플을 특성화 하는 이벤트의 원하는 번호를 취득 합니다. 1 x 10⁴ 5 x 10 후속 정렬 단계에 대 한 특정 게이트 결정을 정렬 하기 전에⁴ 이벤트를 분석 합니다.
   1. 결정 문: 림프 구 및 조상 세포 게이트 앞으로 산포 (FSC) 및 세포질 파편 (그림 2A-C)¹⁷제외 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 정의. FSC 그리고 SSC 셀 크기/직경 및 세분성에 각각 해당합니다.
      참고: GFP^-, GFP^소호, 그리고 GFP^{안녕하세요} 셀이이 인구 간단 합니다 (그림 2-5)의 분리를 만드는 10-에-100-배 그들의 GFP 형광 강도 측면에서 다릅니다. 살고 죽은 차별이 시점에서 propidium 요오드 (PI) 또는 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) 생존 얼룩을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 이전 실험 PI와 일반적으로 입증 > FACS 후 GFP⁺ 세포의 생존 능력 95%.
   2. 사용 중인 FACS 기계의 매개 변수에 따라 셀 남자를 제외 합니다.
   3. 림프 및/또는 전조 게이츠 내 수 및 GFP⁺ 세포의 백분율을 결정 합니다.
3. GFP^lo GFP^{안녕하세요} 셀 대 대 게이트 GFP^- 에 대 한 정의 phycoerythrin (PE) 및 GFP 농도 사용 합니다.
   참고: Dim GFP 형광을 전시 하는 B 세포와 T 세포 lck:eGFP 라인에 밝은 GFP를 표시. 많은 림프 기관 또는 종양 샘플 포함 모두 GFP⁺ 인구. B 계보 세포/B-모든 GFP^lo 와 T-계보 세포/T-모든은 GFP^{안녕하세요}. GFP^-, GFP^lo및 GFP^{안녕하세요} 셀, 사이 구별 하는 게이트를 정의 하 고 이러한 인구를 별도로 수집(그림 2A-C, 그림 3A-C, 그림 4A 와 그림 5A).
4. 미디어, 정렬의 2 개 mL를 포함 하는 다른 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 또는 추가 분석 (예를 들어, RNA, DNA, 또는 단백질 추출, 여 보세요-이식 등)에 대 한 적절 한 버퍼를 포함 하는 다른 1.5 mL 튜브에 직접 각 세포 인구를 정렬 합니다.
5. 얼음 추가 분석 이전에 순화 된 셀을 유지.

결과

우리 사용 분석 cytometry FACS GFP^소호 및 GFP^{안녕하세요} 세포 thymus, 신장 골 수, 및 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish의 비장 으로부터 분리. 3 개월 된 물고기의 분석 thymus 포함 GFP⁺ 세포 주로 밝혔다. GFP⁺ 세포 림프 게이트 이전 Traver 외.¹⁷에 의해 설명에 주로 국한 되었다. 두 가지 GFP⁺ 인구, GFP^lo와 GFP^{안녕하?...}

토론

우리가 개발 하 고이 B 계보 레이블^3,4다른 D. rerio 모델에 추가 하는 것은 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish에서 B 세포 격리 프로토콜을 제공. 약간 의외로, GFP^로 B 셀이이 라인의 식별이 갔다 2004 년에 그것의 설명부터 주목. 일반적으로, lck 는 T 세포 관련⁶, 간주 됩니다 하지만 최근 연구 발견 예기치 않은 lck...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030