Bösartig und B-Zellen nicht bösartig aus Lck:eGFP Zebrafisch zu isolieren

Zusammenfassung

Transgenen Lck:eGFP Zebrafisch express GFP hoch in T-Lymphozyten und wurden verwendet, um die T-Zell-Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie zu studieren. Diese Linie dient zur Studie B-Zellen, die Lck auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt Reinigung von malignen und nicht-malignen B-Zellen aus Lck:eGFP Zebrafisch.

Zusammenfassung

Zebrafisch (Danio Rerio) sind ein leistungsfähiges Modell Lymphozyten Entwicklung zu studieren. Wie bei Säugetieren besitzen D. Rerio einen adaptiven Immunsystems, die B- und T-Lymphozyten enthält. Studien der Zebrafisch Lymphopoiese sind schwierig, weil Antikörper D. Rerio Zelle Oberflächenmarker zu erkennen in der Regel nicht verfügbar sind, erschweren, Isolierung und Charakterisierung von verschiedenen Lymphozyten Bevölkerungsgruppen, einschließlich B-Linie Zellen. Transgene Linien mit Abstammung-spezifische Fluorophor Ausdruck werden häufig verwendet, um diese Herausforderung zu umgehen. Die transgenen Lck:eGFP -Linie wurde verwendet, um D. Rerio T-Zell-Entwicklung zu studieren und auch für Modell T Zelle Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie (T-ALL) verwendet worden. Obwohl Lck:eGFP Fisch allgemein verwendet wurden, um die T-Linie zu analysieren, wurden sie nicht zur B-Zellen zu studieren. Vor kurzem entdeckten wir, dass viele Zebrafisch B Zellen Lck, auch zum Ausdruck bringen, wenn auch auf einem niedrigeren Niveau. Infolgedessen express Lck:eGFP B-Zellen ebenfalls niedrige Konzentrationen von GFP. Ausgehend von dieser Feststellung, entwickelten wir ein Protokoll, um die Zellen der B-Linie von Lck:eGFP Zebrafisch, reinigen, das wir hier berichten. Unsere Methode beschreibt, wie Sie einen Leuchtstoff-activated Cell Sorter (FACS) B-Zellen aus Lck:eGFP Fisch oder verwandte Linien, wie Doppel-transgenen Rag2:hMYCzu reinigen zu nutzen; LCK:eGFP Fisch. In diesen Zeilen, B-Zellen, insbesondere unreife B-Zellen, ausdrückliche GFP auf niedrig aber nachweisbar Ebenen, so dass sie zu unterscheiden von T-Zellen, die GFP hoch zum Ausdruck zu bringen. B-Zellen können von Knochenmark, Thymus, Milz, Blut oder anderen Geweben isoliert werden. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode um D. Rerio B-Zellen, Studien zu Themen wie Entwicklung von B-Zellen und B-Lymphozyten maligne Erkrankungen konzentriert zu reinigen.

Einleitung

Zebrafisch bieten leistungsfähige Attribute, z. B. genetischen Manipulierbarkeit, hohe Fruchtbarkeit, optische Transparenz und schnelle Entwicklung, die studiert vertebrate Entwicklung mit gentechnische Ansätze ermöglichen. Diese Vorteile zusammen mit der Gemeinsamkeiten der teleost und Säugetieren Hämatopoese machen D. Rerio ideal für in-vivo-Analysen von Lymphopoiese und Lymphozyten Funktion, von ihren ersten Auftritt in Larven im gesamten Erwachsenenalter. Blut-Entwicklung im Zebrafisch stützt sich auf gut erhaltenen genetische Prozesse, die mit Säugetieren geteilt werden, und diese erstrecken sich auf das adaptive Immunsystem. Darüber hinaus sind molekulare Mechanismen für lymphoide Entwicklung bemerkenswert zwischen Zebrafisch und Säugetiere¹konserviert.

In den letzten 2 Jahrzehnten transgenen D. Rerio Linien dieses Label bestimmte Blut Linien und mutierte Linien einen Mangel an diesen Linien^2,3,4,5erstellt wurden. Eine davon, die Lck:eGFP transgene Linie verwendet den Zebrafisch Lymphozyten Protein Tyrosin-Kinase (Lck) Projektträger GFP Ausdruck⁶fahren. Dieses Gen, das von T-Linie Vorstufen und Reifen T-Lymphozyten hoch zum Ausdruck kommt, kann in-vivo Verfolgung der Zebrafischembryonen T-Zell-Entwicklung und ex-Vivo-Reinigung der T-Linie Zellen durch FACS-⁷. Früher wir diese Linie in einem vorwärts-genetische ENU Mutagenese Bildschirm Keimbahn Mutanten anfällig für T-ALL zu identifizieren und somatisch erworbenen genetischen Veranstaltungen im Zusammenhang mit T-Zell Onkogenese^8,9zu studieren.

Vor kurzem hat unser Labor das Dienstprogramm Lck:eGFP Zebrafisch weiter ausgebaut. In Doppel-transgenen Rag2:hMYC (menschliches MYC), Lck:eGFP D. Rerio , die bekanntermaßen T-ALL ¹⁰, entwickeln wir entdeckt, dass B-Linie alle¹¹auch auftreten. Im Gegensatz zu T-ALL in diesem Modell hell durch hohe GFP Expression fluoreszieren, B-ALL sind schwach-Leuchtstofflampen aufgrund des niedrigen GFP, so dass Fische mit B-ALL zu unterscheiden grob mit T-ALL mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Diese differentielle GFP Expression ermöglicht auch die Trennung der GFP^lo B-alle Zellen von GFP^Hallo T-ALL-Zellen mittels FACS¹¹. Niedrige Lck Ausdruck ist übrigens nicht als menschliche B-ALL auch express niedrige Konzentrationen von LCK^11,12Zebrafisch B-ALL, einzigartig. Ebenso normale Zellen der B-Linie von D. Rerio, Mäusen und Menschen auch niedrige Konzentrationen von Lckausdrücken /GLK/LCKmit unreifen B-Zellen mit den höchsten Ausdruck^11,13. Auf einer Basis pro Zelle express B-Linie Zellen LckeGFP Zebrafisch oder Derivat Zeilen 1-10 % soviel GFP als T-Lymphozyten. Diese GFP^lo ausdrückliche Merkmal B-Zell-mRNAs wie pax5, cd79b, Blnk, Btk, Ighm, Ighzund andere Zellen, und kann aus Knochenmark, Thymus, Milz oder peripheren gereinigt werden Blut-¹¹. Daher isoliert beide B - und T-Linie Zellen aus LckeGFP Zebrafisch und im Falle von rag2hMYC, LckeGFP Tiere, B - und T-alle Zellen sowie¹¹.

Hier präsentieren wir unsere Protokoll effizient FACS reinigen nicht-malignen B-Zellen aus Lck:eGFP Zebrafisch und nicht-bösartigen oder malignen B-Zellen der rag2hMYC; LCK:eGFP Fisch, mit verschiedenen Quelle Gewebe. Solche Zellen können ebenso durch Durchflusszytometrie ohne FACS Isolierung, quantifiziert werden, falls gewünscht. Entdeckung der niedrigen Lck Ausdruck- und folglich niedrigen GFP Expression-durch B Zellen öffnet neue Türen der experimentellen Möglichkeiten für LckeGFP Zebrafisch, wie z. B. in Vivo B Zellen-Studien. So hat dieser transgenen Linie, erstmals im Jahr 2004 berichtet neues Leben wie wir es um neue Erkenntnisse über Zebrafisch adaptive Immunität aufzulesen nutzen wollen.

Protokoll

Alle Verfahren im Zusammenhang mit Zebrafisch stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Oklahoma Health Sciences Center.

1. nicht-malignen B und T-Lymphozyten aus transgenen Lck:eGFP Fische isolieren

1. Den Fisch mit 0,02 % Tricaine (MS-222) im System Fischwasser zu betäuben.
2. 2 – 6 Monate alten Fisch für fluoreszierende Thymi an der Dorsomedial Aspekt der Kiemen Hohlraum der Zebrafisch und anderen umkonstruiert¹⁴befinden zu untersuchen. Verwenden Sie eine Epifluoreszenz-Mikroskop (470/40 Erregung Wellenlänge und 525/50 Emission Filter), GFP zu erkennen.
3. 50 mL von Filter-sterilisierte 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) mit 1 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin (Sortierung Medien) im Voraus vorbereitet. Nicht verwendete Sortierung Datenträger können für bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden.
4. Die Fische einzuschläfern, indem man sie in einen Becher mit 0,2 % Tricaine für ca. 5 min, gefolgt von Eis Bad eintauchen. Tod von der Einstellung der Kiemendeckel (Gill) Bewegung zu bestätigen.
5. Legen Sie den euthanasierten Fisch in einer Petrischale und sezieren Sie lymphatischen Organe des Interesses, das fluoreszierende Mikroskop sezieren die GFP⁺ Thymi¹⁴und Hellfeld Mikroskopie Einstellungen an der Niere Knochenmark und Milz¹⁵sezieren zu. Hier präsentierten Ergebnisse wurden mit 3 Monate alten Fisch. Lymphozyten Proportionen und absoluten Zahlen variieren je nach Alter und Genotyp (siehe Diskussion für weitere Details).
6. Legen Sie jedes seziert Organ in einer 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL des kalten Medien sortieren.
7. Das Gewebe auf Eis mit ein Stößel-Mikro-Schlauch-Homogenisator zu homogenisieren.
8. Ein Siebfilter 35 µm, eine einzelne Zelle Aussetzung zu generieren durchlaufen Sie homogenisierte Gewebe. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Analyse.

2. Isolierung bösartigen Lymphozyten aus Doppel-transgenen Rag2:hMYC; Lck:eGFP Zebrafisch

1. Bildschirm ab 2-4 Monate, mikroskopisch Rag2:hMYC; LCK:eGFP Fisch für abnorme GFP-Muster.
   Hinweis: B-Zellen sind GLP^lo in Lck:eGFP Hintergrund, so dass B-ALL Praxis erfordert anzuerkennen; T-ALL ist offensichtlich, da T-Zellen GFP^Hallosind. Infolgedessen hat die Rag2:hMYC, Lck:eGFP Dual-transgene Linie zwei Phänotypen: hell-Leuchtstofflampen T-ALL, die in der Regel ergeben sich aus dem Thymus und erweitern in den Leib und schwach Leuchtstoff B-ALL.
   1. Den Fisch mit "niedrigen" Belichtungseinstellungen (200 ms, 2,4 X Gain), helle T-ALL (Abbildung 1A) und "hohe Exposition" identifizieren Bildschirm mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (1,5 s, 3,4 X Gain), dim B-ALL (Abbildung 1A) zu identifizieren. WT-Kontrollen und Pre-leukämischen Fische haben GFP nur im Thymus (Abbildung 1 b) lokalisiert.
2. Zu betäuben Sie, und untersuchen Sie die Fische wie in 1.1 – 1.2 beschrieben.
3. Kategorisieren Sie die Fische, die basierend auf der Ausdehnung der GFP Fluoreszenz, mit einem einfachen drei Kategoriensystem:
   Hinweis: Ebene 1: Fluoreszenz erscheint als ein Zebrafischembryonen Tumor mit nur begrenzten lokalen Ausbreitung.
   Stufe 2: Fluoreszenz scheint jenseits der Thymus, an denen < 50 % des Körpers.
   Stufe 3: Fluoreszenz erstreckt sich über 50 % des Körpers.
4. Trennen Sie den Fisch durch alle von denen ohne Krebs. Überwachen Sie vorab leukämischen Fisch (z.B. Fisch ohne GFP⁺ Tumoren) einmal monatlich für die Entwicklung von neuen ALL. Von ~ 9 Monate, alle Rag2:hMYC, Lck:eGFP Fische entwickeln T-ALL, B-ALL, oder beides.
5. Für T - oder B-ALL isoliert Zelle, wählen Sie Stufe 3 Fische (alle mit > 50 % des Körpers), die Ausbeute mehr als 2 x 10⁶ alle Zellen und in der Regel viel mehr.
6. Die Fische wie in Schritt 1.4 einschläfern.
   Hinweis: Es gibt zwei Methoden, um alle Zellen zu erhalten: Ganzkörper-Homogenisierung und einem peritonealen waschen Technik¹⁶. Die Methoden unterscheiden sich in der absoluten Zahl von Zellen gesammelt für die Sortierung, und somit die Beträge der FACS erforderlich und Kosten (siehe Diskussion für weitere Details).
7. Für beide Methoden zuerst legen Sie den euthanasierten Fisch in einer Petrischale und mit einer Rasierklinge entfernen Sie den Kopf einschließlich der Zebrafischembryonen Region. Dies kann separat verarbeitet werden, wenn gewünscht, oder für histologische Färbung verwendet.
8. Peritoneal Wash Methode
   1. Mit Hilfe einer Pipette P1000, Waschen der Bauchhöhle Fisch mit 500 µL Kälte Sortierung Medien, sammeln die Zellen und die Medien in eine 5 mL-Tube.
   2. Mit einem frischen Pipettenspitze, eine weitere 200 – 300 µL kalte Sortierung Medien in die Körperhöhle injizieren. Dann üben Sie sanften Druck mit der Spitze der Pipette, um die Fische Körper, die Zellen aus der Körperhöhle zu extrudieren. Sammeln Sie diese Medien und verleihen Sie der 5 mL Tube.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2.8.2 2 – 3 Mal. Halten Sie die gesammelten Zellen bei der Sortierung von Medien auf Eis.
   4. Filtern Sie die Zellsuspension, obwohl Netzchen 35 µm Filtern vor Flow Cytometry/FACS und halten die Zellen auf dem Eis bis zur Analyse.
9. Ganzen Körper Homogenisierung
   1. Nach dem Entfernen der Fischkopf, legen Sie den Körper in eine 1,5 mL-Tube mit 200 µL Medien zu sortieren.
   2. Homogenisieren des Körpers mit ein Stößel-Mikro-Schlauch-Homogenisator.
   3. Fügen Sie eine zusätzliche 300 µL der kalten Medien sortieren. Filtern Sie die Zellsuspension, obwohl ein Siebfilter 35 µm. Fügen Sie Sortier Medien hinzu, wie notwendig, um alle Zellen durch den Filter zu waschen, bis nur Gewebe Trümmer auf dem Filter bleibt. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Analyse.

(3) durchflusszytometrischen Analyse der normalen oder malignen B-Lymphozyten

1. Festlegen Sie durchflusszytometrischen Analyse und/oder nach Anleitung des Herstellers FACS Parameter.
2. Gewünschte Anzahl der Ereignisse, zunächst die Probe charakterisieren zu erwerben. 1 x 10⁴ bis 5 x 10⁴ Ereignisse vor der Sortierung zu bestimmen spezifische Tore für Sortierung Folgeschritte zu analysieren.
   1. Toren ermitteln: Lymphozyten und Vorläuferzellen Zelle Tore mit forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Parameter, ausgenommen Zelltrümmer (Abbildung 2A-C)¹⁷zu definieren. FSC und SSC entsprechen Zelle Größe/Durchmesser und Granularität, beziehungsweise.
      Hinweis: GFP^–, GFP^lound GFP^Hallo Zellen unterscheiden 10-auf-100-Fach im Hinblick auf ihre GFP-Fluoreszenz-Intensität, wodurch Trennung dieser Populationen unkompliziert (Abbildungen 2-5). Lebenden Toten Diskriminierung kann an dieser Stelle mit Propidium Jod (PI) oder 7-Aminoactinomycin D (7-AAAD) Lebensfähigkeit Färbung bewertet werden. Bisherigen Experimente mit PI in der Regel zeigen > 95 % Lebensfähigkeit der Zellen GFP⁺ nach FACS.
   2. Ausschließen der Zelle Dubletten, entsprechend den Parametern der FACS-Maschine verwendet wird.
   3. Innerhalb der lymphatischen und/oder Vorläufer Tore bestimmen Sie die Anzahl und Prozentsatz der GFP⁺ Zellen.
3. Verwenden Sie Phycoerythrin (PE) und GLP-Intensitäten, definieren Sie Tor für GFP^– vs. GFP^lo vs. GFP^Hallo Zellen.
   Hinweis: B-Zellen weisen dim GFP Fluoreszenz und T-Zellen zeigen helle GFP in Lck:eGFP Linien. Viele lymphatischen Organe oder Tumorproben enthalten sowohl GFP⁺ Bevölkerung. B-Linie Zellen/B-ALL GFP^lo und T-Linie Zellen/T-alle sind GLP^Hallo. Definieren Sie Tore GFP^–, GFP^lo, GFP^Hallo Zellen unterscheiden, und dieser Bevölkerungen getrennt zu sammeln (Abbildung 2A-C, Abb. 3A-C, Abbildung 4A und Figur 5a).
4. Jede Zellpopulation in verschiedenen 15 mL Polypropylen Röhrchen mit 2 mL des Sortierens Medien oder direkt in verschiedenen 1,5 mL Röhrchen mit einer entsprechenden Puffer für weitere Analysen (z. B. RNA oder DNA-Protein-Extraktion, allo-Transplantation, etc.) zu sortieren.
5. Halten Sie die gereinigte Zellen auf dem Eis vor weitere Analysen.

Ergebnisse

Wir nutzten Durchflusszytometrie analysiert und FACS, GFP^lo und GFP^Hallo Zellen aus Thymus, Knochenmark Niere und Milz Lck:eGFP transgenen Zebrafisch zu isolieren. Analyse der 3-Monate-alten Fisch ergab, dass der Thymus enthalten meist GFP⁺ Lymphozyten. GFP⁺ Zellen wurden weitgehend auf die lymphatischen Tor zuvor beschrieben von Traver Et Al.¹⁷beschränkt. ^{Zwei verschiedene Populationen der GFP+ ...}

Diskussion

Wir entwickelt und bieten ein Protokoll zur B-Zellen aus Lck:eGFP transgenen Zebrafisch, isolieren das Hinzufügen anderer D. Rerio Modelle mit B-Linie Etiketten^3,4. Etwas überraschend ging die Identifizierung der GFP^lo B Zellen in dieser Zeile seit seiner Beschreibung im Jahr 2004 unbemerkt. In der Regel Lck gilt als T-Zell-spezifische⁶, aber neuere Studien gefunden, unerwartete Lck Ausdruck...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030